抗嗜水氣單胞菌解淀粉芽孢桿菌的抗菌機理研究及其微膠囊制劑的安全性評價.pdf

1、抗生素的濫用已經(jīng)引起了嗜水氣單胞菌日益嚴(yán)重的耐藥性問題,導(dǎo)致嗜水氣單胞菌引起的養(yǎng)殖魚類疾病的有效防治難度加大,因而尋求抗生素的理想替代品迫在眉睫。芽孢桿菌廣泛存在于自然界中,能夠形成內(nèi)生孢子,具有很強的抗逆性,不僅能夠防病治病,促進(jìn)動物生長,而且具有無副作用、無殘留、無污染、不產(chǎn)生耐藥性等特點,是替代抗生素的理想制劑,具有巨大的應(yīng)用價值。鑒此,本研究篩選了一株抗嗜水氣單胞菌解淀粉芽孢桿菌優(yōu)良菌株G1,在確定了其對嗜水氣單胞菌及其引起的草

2、魚細(xì)菌性敗血癥具有良好抗菌防病效果的基礎(chǔ)上,通過比較蛋白質(zhì)組學(xué)和抗菌相關(guān)基因檢測探討了其抗菌機制;優(yōu)化了其微膠囊的實驗室生產(chǎn)工藝,并進(jìn)一步評價了微膠囊的耐酸、耐堿性能及其對水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的安全性,為后續(xù)開發(fā)可替代抗生素的解淀粉芽孢桿菌微膠囊奠定了堅實的基礎(chǔ)。本研究主要結(jié)果如下:
　　1.抗嗜水氣單胞菌解淀粉芽孢桿菌的分離及其對嗜水氣單胞菌的拮抗效果
　　從養(yǎng)殖池污泥中分離篩選了一株優(yōu)良的抗嗜水氣單胞菌芽孢桿菌 G1,通過API

3、50CH細(xì)菌鑒定系統(tǒng)以及16S rDNA序列分析法,菌株G1被鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens),其16S rDNA序列(GenBank登錄號:HM245965)與基因庫中芽孢桿菌屬菌株的16S rDNA序列有99％?100%的同源性,而且與解淀粉芽孢桿菌Ba-74501的16S rDNA序列(GenBank登錄號:DQ422953)的親緣關(guān)系最近。菌株G1對病原性嗜水氣單胞菌具有廣譜拮抗活性,

4、對嗜水氣單胞菌的生長具有良好的抑制作用,對草魚抗嗜水氣單胞菌感染具有良好的效果。
　　2.抗嗜水氣單胞菌解淀粉芽孢桿菌的比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析
　　以抗嗜水氣單胞菌解淀粉芽孢桿菌G1的無抗菌活性突變株作為對照,利用雙向凝膠電泳(2-DE)技術(shù)建立了解淀粉芽孢桿菌G1及其突變株菌體蛋白2-DE圖譜,并進(jìn)一步通過質(zhì)譜檢測和數(shù)據(jù)庫檢索鑒定了解淀粉芽孢桿菌 G1的差異蛋白質(zhì)。實驗結(jié)果表明,解淀粉芽孢桿菌G1的2-DE圖譜蛋白質(zhì)點為113

5、5個,匹配率為89.37%;以解淀粉芽孢桿菌G1突變株的菌體蛋白2-DE圖譜作對照,解淀粉芽孢桿菌G1共有65個差異蛋白質(zhì)點,其中36個高豐度的差異蛋白質(zhì)經(jīng)鑒定與蛋白質(zhì)合成與修飾、能量代謝、菌體抗逆自我保護(hù)、耐藥以及抗菌等生理功能有關(guān),揭示解淀粉芽孢桿菌G1除了其產(chǎn)生的抗菌蛋白直接參與抗菌作用外,其對環(huán)境的抗逆能力、生長性能對其抗菌作用也具有重要的意義。
　　3.抗嗜水氣單胞菌解淀粉芽孢桿菌的抗菌素相關(guān)基因分析
　　分別對抗

6、嗜水氣單胞菌的解淀粉芽孢桿菌 G1的抗菌素相關(guān)基因進(jìn)行了 PCR擴增與測序,并對其編碼產(chǎn)物的氨基酸序列、跨膜螺旋信號、結(jié)構(gòu)域與二級結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了預(yù)測與分析。實驗結(jié)果表明,菌株G1僅含有伊枯草菌素合成必需基因,該基因與GenBank基因庫中芽孢桿菌屬其他細(xì)菌的伊枯草菌素A、桿菌抗霉素D、抗霉枯草菌素等伊枯草菌素家族基因自然聚類,與枯草芽孢桿菌MH25株和RB14株的伊枯草菌素 A基因有98%的高度同源性,而且其編碼產(chǎn)物的氨基酸序列與GenB

7、ank中芽孢桿菌屬其他細(xì)菌的伊枯草菌素、伊枯草菌素 A、脂肽類化合物bacillorin、芽孢菌素 D等抗菌物質(zhì)的氨基酸序列有高度同源性,與枯草芽孢桿菌MH25的伊枯草菌素A合成酶B(GenBank登錄號:ABY89499)的親緣關(guān)系最近。此外,菌株G1伊枯草菌素合成必需基因的編碼產(chǎn)物不具有明顯的跨膜結(jié)構(gòu),但其結(jié)構(gòu)域中存在AMP結(jié)合位點和PP結(jié)合位點,二級結(jié)構(gòu)中存在α螺旋、伸展鏈、β轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲。
　　4.抗嗜水氣單胞菌解淀粉芽

8、孢桿菌微膠囊的制備工藝與特性
　　以明膠為壁材,采用單因素法,考察了明膠濃度、進(jìn)風(fēng)溫度、進(jìn)料速度、空氣流量等因素對抗嗜水氣單胞菌解淀粉芽孢桿菌微膠囊有效含菌量的影響,并進(jìn)一步通過正交試驗設(shè)計優(yōu)化了解淀粉芽孢桿菌微膠囊制劑的噴霧干燥工藝參數(shù),觀察了其微膠囊顆粒形態(tài)以及對人工模擬胃液和腸液的耐受力。實驗結(jié)果表明,解淀粉芽孢桿菌微膠囊噴霧干燥的最佳制備工藝條件為:明膠濃度為3.0%,進(jìn)風(fēng)溫度為155℃,進(jìn)料速度為8 ml/min,空氣流

9、量為700 L/h,各因素對解淀粉芽孢桿菌微膠囊噴霧干燥工藝的影響程度為:明膠濃度>進(jìn)料速度>空氣流量>進(jìn)風(fēng)溫度。此外,解淀粉芽孢桿菌微膠囊制劑的顆粒呈球形,表面有凹陷,但沒有孔和裂紋,顆粒粒徑分布基本均勻,平均大小為9.22μm,對人工模擬胃液和腸液具有較好的耐受力。
　　5.抗嗜水氣單胞菌解淀粉芽孢桿菌微膠囊的安全性評價
　　參照《GB/T21805-2008化學(xué)品藻類生長抑制試驗》、《GB/T13266-91水質(zhì)物質(zhì)對

10、蚤類(大型蚤)急性毒性測定方法》、《GB/T13267-91水質(zhì)物質(zhì)對淡水魚(斑馬魚)急性毒性測定方法》、《漁藥臨床試驗技術(shù)規(guī)范》等國家標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)法規(guī),觀察了解淀粉芽孢桿菌微膠囊對小球藻生長抑制作用以及對大型蚤、斑馬魚和草魚的急性毒性,分析了其對養(yǎng)殖水體主要理化因子的影響,實驗結(jié)果表明,解淀粉芽孢桿菌微膠囊在終濃度為0.2 mg/L~2000 mg/L時對小球藻生長具有促進(jìn)作用,對小球藻的半數(shù)抑制濃度大于2000 mg/L,而且其對大型

11、蚤、斑馬魚和草魚的半數(shù)致死濃度也大于2000 mg/L(或mg/Kg體重)。此外,在養(yǎng)殖水體中加入解淀粉芽孢桿菌微膠囊至終濃度為0.2 mg/L~2000 mg/L后14天內(nèi),各濃度組的氨氮含量、硫化物和pH值均緩慢下降,僅亞硝酸鹽氮含量稍微升高后逐漸緩慢降低,但這些理化因子的變化與解淀粉芽孢桿菌微膠囊的加入量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。因此,解淀粉芽孢桿菌微膠囊實際無毒,對養(yǎng)殖水中氨氮、亞硝酸鹽氮、硫化物和pH等理化因子的影響均控制在蝦虎魚仔魚、黃