蒙藥復(fù)方特潤舒都樂石油醚提取物及其主要單體抗炎信號通路的研究.pdf

1、炎癥（inflammation）作為一種臨床常見的癥狀，普遍發(fā)生于機體各個部位。蒙醫(yī)藥是內(nèi)蒙古特色醫(yī)藥。前期研究已經(jīng)確立了蒙藥復(fù)方特潤舒都樂“Terun sodolol”，具有很好的抗炎和提高免疫作用，在動物模型以及臨床奶牛乳房炎的治療中取得了顯著療效，但尚存在用藥劑量過大、作用機理不清楚等問題，故進一步研究其抗炎作用顯著的石油醚提取物及主要單體的抗炎信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，旨在細胞分子水平上為其二次開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。
　　為此，應(yīng)用天然藥

2、物化學(xué)、有機化學(xué)等知識，利用液相色譜等技術(shù)分離鑒定有效活性成分，結(jié)合文獻指導(dǎo)，確立了石油醚提取物有效單體成分，利用脂多糖（LPS）誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細胞體外建立炎癥模型，觀察石油醚提取物、單體及單體復(fù)合物抗炎作用及LPS-TLR4-cytokines/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
　　蒙藥復(fù)方“Terun sodolol”石油醚提取物體外抗炎作用的研究試驗如下：設(shè)置不同的LPS濃度（濃度設(shè)置為0.5、1、2、5、10、25μg/

3、mL），干預(yù)RAW264.7巨噬細胞24h后，收集細胞上清進行ELISA檢測，檢測標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得出上清液腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、白介素1β（IL-1β）含量，根據(jù)結(jié)果確定最顯著的LPS作用濃度為25μg/mL。蒙藥復(fù)方“Terun sodolol”石油醚提取物1、5、10、25、50mg/mL作用于RAW264.7巨噬細胞，檢測細胞增殖能力（CCK-8法），結(jié)果顯示50mg/mL濃度組與空白對照

4、組比較有顯著差異（P<0.05），對細胞生長有抑制作用，其余各組均無顯著差異(P>0.05)，說明對細胞生長無影響。故后期試驗選擇5mg/mL、10mg/mL、25mg/mL濃度梯度進行，實驗分為空白對照組，炎癥模型組，炎癥模型+陽性對照組，炎癥模型+藥物處理組。ELISA檢測TNF-α、IL-6、IL-1β含量，Real-time方法檢測TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA表達，結(jié)果顯示：LPS模型組比空白對照組TNF-α、IL-

5、6、IL-1β蛋白分泌及mRNA表達均顯著升高（P<0.05），炎癥模型+藥物處理組 TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白分泌及mRNA表達與LPS模型組比較顯著性降低（P<0.05），呈現(xiàn)劑量依賴性。說明蒙藥復(fù)方“Terun sodolol”石油醚提取物有抗炎和細胞保護效應(yīng)，與抑制炎性細胞因子的產(chǎn)生有關(guān)。
　　蒙藥復(fù)方“Terun sodolol”石油醚提取物主要單體及其單體復(fù)合物對巨噬細胞RAW264.7細胞作用的有效濃度及時

6、間：蒙藥復(fù)方“Terun sodolol”主要單體及單體復(fù)合物作為試驗藥物，作用于RAW264.7巨噬細胞，檢測細胞增殖能力。細胞增殖能力檢測實驗（CCK-8）結(jié)果顯示：蒙藥復(fù)方主要單體成分胡黃連苷Ⅱ、姜黃素、大黃素、大黃酸，高、中、低劑量組在不同時間點（0、6、12、24、48h）作用于RAW264.7細胞，并沒有明顯影響細胞生存活力。顯示在各單體高濃度組作用時間48h顯著地降低了細胞生存率，并發(fā)現(xiàn)單體復(fù)合物的保護效應(yīng)較單體略微大一些

7、。因此，根據(jù)不同濃度下保護效應(yīng)明顯的原則和藥物組合的原則選擇了高濃度單體組和中等濃度單體復(fù)合物組，作用時間點為24h。
　　蒙藥復(fù)方“Terun sodolol”石油醚提取物主要單體及單體復(fù)合物對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細胞細胞增殖能力的影響：實驗分為正常細胞對照組、炎癥模型組、炎癥模型+各單體給藥組、炎癥模型+單體復(fù)合物組、炎癥模型+吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽組（PDTC；20μM）、炎癥模型+PDTC+單體復(fù)合物組、炎癥模型+地

8、塞米松組（Dex；10μg/mL）。結(jié)果顯示：與正常細胞對照組比較，LPS的刺激顯著降低了巨噬細胞活力，而單體及單體復(fù)合物試驗藥物及PDTC、地塞米松陽性對照藥減輕該細胞的死亡，不同程度地恢復(fù)了細胞的存活率。
　　蒙藥復(fù)方“Terun sodolol”石油醚提取物主要單體及單體復(fù)合物對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細胞產(chǎn)生細胞因子的影響：實驗分為正常細胞對照組、炎癥模型組、炎癥模型+各單體給藥組、炎癥模型+單體復(fù)合物組、炎癥模型+ P

9、DTC、炎癥模型+PDTC+單體復(fù)合物組、炎癥模型+地塞米松組。ELISA結(jié)果顯示LPS模型組較正常細胞對照組TNF-α、IL-6、IL-1β分泌顯著升高；各單體及單體復(fù)合物試驗藥物、陽性對照藥與模型組比較均顯著降低了TNF-α、IL-6、IL-1β分泌。
　　蒙藥復(fù)方石油醚提取物主要單體及單體復(fù)合物對 LPS誘導(dǎo) RAW264.7細胞TLR-4/NF-κB信號通路的研究：實驗分為正常細胞對照組、炎癥模型組、炎癥模型+各單體給藥組

10、、炎癥模型+單體復(fù)合物組、炎癥模型+ PDTC、炎癥模型+PDTC+單體復(fù)合物組、炎癥模型+地塞米松組。蛋白質(zhì)水平，用Western blot分析各單體及單體復(fù)合物試驗藥物對TLR4/NF-κB信號通路的影響，檢測了磷酸化IκBα（P-IκBα）、P65、P- P65（磷酸化P65）、TLR-4蛋白，結(jié)果顯示LPS模型組與正常對照組比較TLR-4、P-IκB、NF-κBP-P65蛋白表達顯著，說明LPS刺激激活了TLR-4/NF-κB信

11、號通路，而蒙藥復(fù)方“Terun sodolol”石油醚提取物單體及單體復(fù)合物試驗藥拮抗內(nèi)毒素LPS的作用顯著降低了TLR-4、P-IκB、NF-κBP-P65蛋白的表達；real-time檢測TLR-4、NF-κBP65，結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)錄水平LPS模型組與正常對照組比較 TLR-4、NF-κB-P65mRNA表達顯著，而蒙藥復(fù)方石油醚提取物單體及單體復(fù)合物試驗藥拮抗內(nèi)毒素 LPS的作用顯著降低 TLR-4、NF-κBP65蛋白的mRNA表

12、達。采用凝膠遷移實驗（EMSA）檢測DNA結(jié)合能力，檢測NF-κBP65（核蛋白）活性，結(jié)果LPS模型組與正常對照組比較差異顯著，NF-κBP65（核蛋白）活性及含量增加，而蒙藥復(fù)方石油醚提取物單體及單體復(fù)合物試驗藥削弱內(nèi)毒素LPS的作用，顯著降低了NF-κBP65（核蛋白）活性及含量。
　　以上結(jié)果說明蒙藥復(fù)方石油醚提取物、單體及其單體復(fù)合物試驗藥拮抗內(nèi)毒素LPS的作用，是通過LPS-TLR4?cytokines/NF-κB信號