蒙藥特潤舒都樂水母液浸膏及其主要單體通過TLR4的抗炎信號轉導機制研究.pdf

1、蒙藥特潤舒都樂(TRSDL)是課題組為治療奶牛乳房炎而配置的，經(jīng)多年研究應用于治療奶牛乳房炎的抗炎免疫復方。發(fā)現(xiàn)蒙藥特潤舒都的水母液浸膏也具有良好的抗炎和提高機體免疫力的作用。研究復方蒙藥特潤舒都樂水母液浸膏及其主要活性成分的抗炎免疫機制，為蒙藥特潤舒都樂治療奶牛乳腺炎提供理論依據(jù)，實驗方法和結果如下:
　?、俨捎眉毦嗵荓PS誘導小鼠RAW264.7細胞構建炎癥細胞模型。
　?、诓捎肅CK8法檢測TRSDL的水母液浸膏及

2、其主要活性成分對RAW264.7細胞的增殖作用的影響，結果:低濃度TRSDL水母液浸膏（1.00、5.00、10.00、25.00 mg/mL）對小鼠RAW264.7細胞沒有生長抑制作用，與不加藥物的空白對照組相比沒有顯著性差異(p＞0.05)，而高濃度TRSDL水母液浸膏（50.00mg/mL）顯著抑制小鼠RAW264.7細胞的生長(p＜0.05); TRSDL水母液浸膏的主要活性成分單體梔子苷20mmol/L、沒食子酸32μg/L和

3、鹽酸小檗堿40μ mol/L分別單獨作用48h能夠明顯抑制RAW264.7細胞的生長(p＜0.05)。由3種單體組成的復合物在該濃度時作用48h也能夠顯著抑制RAW264.7細胞的生長(p＜0.05)。
　?、鄄捎脽晒舛縍T-PCR法檢測TRSDL的水母液浸膏對LPS誘導RAW264.7細胞的IL-1、IL-6、TNF-α、TLR4及NF-κB mRNA的影響，ELISA的方法檢測IL-1、IL-6、TNF-α蛋白質的表達，We

4、stern Blotting法檢測TLR4、NF-κB蛋白質的表達，結果:TRSDL的水母液浸膏濃度依賴性地抑制LPS誘導的小鼠RAW264.7細胞產生炎癥因子IL-1、IL-6及TNF-α mRNA的含量及其蛋白質的表達(p＜0.05)，10mg/mL和25mg/mLTRSDL水母液浸膏抑制作用與地塞米松的效果相當(p＜0.05)。TRSDL的水母液浸膏濃度依賴性地抑制LPS誘導的小鼠RAW264.7細胞TLR4、NF-κB mRNA

5、和蛋白質的表達。
　　④WST-8方法檢測TRSDL水母液浸膏的活性成分及其復合物對LPS誘導的RAW264.7細胞增殖率的影響，結果:單體梔子苷、沒食子酸、鹽酸小檗堿及3種單體復合物、NF-κB抑制劑PDTC和地塞米松分別能夠顯著緩解LPS對小鼠RAW264.7細胞增殖的抑制作用(p＜0.05)。
　?、莶捎肊LISA的方法檢測TRSDL水母液浸膏的主要活性成分對LPS誘導的RAW264.7細胞的炎性因子IL-1、IL-6

6、和TNF-α釋放的影響，結果:梔子苷、沒食子酸、鹽酸小檗堿及3種單體復合物能夠顯著抑制LPS誘導的小鼠RAW264.7細胞的IL-1、IL-6及TNF-α表達，與蒙藥特潤舒都樂水母液浸膏結果均一致。
　　⑥進一步運用Western Blotting法和EMSA法檢測TRSDL水母液浸膏的主要活性成分的單體及復合物對LPS誘導的RAW264.7細胞p-IκBα、p-p65、p65及TLR4的蛋白表達和P65與啟動子結合活性的影響。結

7、果:TRSDL單體梔子苷、沒食子酸、鹽酸小檗堿及3種單體組成的復合物、NF-κB抑制劑PDTC和地塞米松不影響總p65蛋白質水平，但分別能夠顯著抑制LPS誘導的小鼠RAW264.7細胞的磷酸化IκBα和p65蛋白質表達(p-IκBα和p-p65)(p＜0.05)。各用藥組顯著抑制LPS誘導的小鼠RAW264.7細胞TLR4 mRNA含量和蛋白質表達，與蒙藥特潤舒都樂水母液浸膏結果一致。單體梔子苷、沒食子酸、鹽酸小檗堿、3種單體復合物、N

8、F-κB抑制劑PDTC和地塞米松分別能夠顯著減少LPS誘導的小鼠RAW264.7細胞p65與啟動子結合的活性(p＜0.05)。
　　綜上所述，實驗成功構建了細菌脂多糖LPS誘導小鼠RAW264.7細胞炎癥細胞模型;確定了蒙藥特潤舒都樂水母液浸膏及其主要活性成分的用藥量:對小鼠RAW264.7細胞的作用濃度可選為水母液浸膏低于（50.00mg/mL），而TRSDL水母液浸膏的主要活性成分單體梔子苷、沒食子酸和鹽酸小檗堿分別選用文獻中

9、常用的20mmol/L、32μg/L、40μmol/L;蒙藥特潤舒都樂水母液浸膏能夠顯著抑制LPS誘導RAW264.7細胞的TNF-α、IL-1和IL-6 mRNA含量及其蛋白質的表達，同時在轉錄水平和蛋白質水平顯著抑制其TLR4和NF-κB含量，提示蒙藥特潤舒都樂水母液浸膏可通過TLR4-NF-κB通路發(fā)揮抗炎免疫作用。蒙藥特潤舒都樂的3種單體及其復合物能在轉錄水平和蛋白水平顯著下調LPS誘導RAW264.7細胞的IL-1、IL-6和