Strobilurin類殺菌劑醚菌酯和肟菌酯的作用機制、檢測方法研究及其在柑橘中的殘留規(guī)律.pdf

1、柑橘采后經常因真菌感染而造成較大的經濟損失,利用殺菌劑控制真菌病害是一種有效的途徑。醚菌酯和肟菌酯屬新型Strobilurin類殺菌劑,具有安全、廣譜、高效的特點,可有效防治柑橘采后的真菌病害,但相關作用機制及其在柑橘中的殘留檢測研究報道較少。本論文針對醚菌酯和肟菌酯應用的生產實踐需求,開展醚菌酯和肟菌酯的作用機制、殘留檢測方法及其在柑橘中降解規(guī)律研究,以促進柑橘及其制品的食用安全。主要研究結果如下:
　　1.醚菌酯和肟菌酯對三種

2、病原真菌的作用效果及機制選用柑橘青霉、綠霉、炭疽菌進行體外培養(yǎng),當培養(yǎng)基中分別含有兩種殺菌劑時,醚菌酯和肟菌酯對三種病原真菌的半最大效應濃度(EC50)分別為13.22,66.92,273.74μg/mL和0.18,0.32,1.37μg/mL。將三種真菌于EC50濃度水平的含醚菌酯和肟菌酯培養(yǎng)基中培養(yǎng),菌絲蛋白含量為檢測目標,青霉菌和綠霉菌可溶性蛋白含量分別從3h和1h后降低并持續(xù)至24h,炭疽菌可溶性蛋白含量從開始下降到再次上升只維

3、持了3h,此后則逐漸升高;當培養(yǎng)基中同時含有旁路氧化酶抑制劑SHAM時,醚菌酯和肟菌酯抑制三種病原真菌的EC50濃度水平明顯下降,各菌絲體可溶性蛋白總水平也明顯降低。結果表明,醚菌酯和肟菌酯能較好地抑制三種病原真菌生長,SHAM與兩種殺菌劑均有協(xié)同作用效果。
　　采用差速離心法獲得真菌線粒體,分別研究0.2-200μg/mL的醚菌酯和肟菌酯對真菌線粒體內膜上四種酶復合體活性的影響。結果表明,兩者對復合體的活性影響趨同,四種復合體活

4、性的抑制率與藥劑濃度成正相關,但各處理濃度下的復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ受抑制程度均不如復合體Ⅲ;相同濃度處理下,醚菌酯和肟菌酯對青霉菌和綠霉菌中的復合體Ⅲ抑制程度較炭疽菌的大。醚菌酯和肟菌酯可通過影響線粒體呼吸鏈酶復合體活性而抑制真菌的生長。
　　2.醚菌酯和肟菌酯QuEchERS-HPLC同步檢測方法的建立以AOAC認可的QuEchERS法為基礎,樣品采用含1％乙酸的乙腈溶液,通過優(yōu)化吸附劑確定采用PSA:C18(4:1/m:m)作為最

5、佳前處理條件。同步檢測采用210nm的波長,甲醇:水(80:20)為流動相洗脫,醚菌酯和肟菌酯的保留時間分別為9.3 min和12.3 min。當加標濃度為1.0,0.5,0.05 mg/kg時,橘肉和橘皮中醚菌酯的平均回收率約為83.93%~95.50%和80.08%~93.77%,相對標準偏差 RSD%分別為1.55%~4.50%和1.80%~4.24%;肟菌酯的平均回收率約為80.84%~93.47%和80.00%~91.00%,

6、相對標準偏差RSD%分別為3.00%~4.20%,1.40%~5.20%。醚菌酯和肟菌酯的最低檢出濃度分別為0.005和0.008 mg/kg,符合農殘分析的國際標準要求。
　　3.醚菌酯和肟菌酯ELISA檢測方法的建立1)將含醚菌酯和肟菌酯共有活性基團的(E)-2(2-溴甲基苯基)-2-甲氧亞氨基乙酸甲酯(OEBr)與巰基丙酸反應獲得羧基,以其為連接臂,采用活化酯法、混合酸酐法分別制備免疫原和包被原,反應產物分別利用紫外吸收掃描

7、與結合比的測定、紅外、質譜、核磁、SDS-PAGE方法進行鑒定表明,免疫原和包被原合成成功,其中免疫原的結合比為12.8:1,達到動物免疫的要求。
　　2)免疫原與弗氏佐劑充分乳化制備疫苗,采用多點皮下、腿部肌肉免疫3只新西蘭大白兔,為期3個月。當3只兔子的抗血清效價分別為64000,32000,32000且不再上升時,采用效價最高的抗血清進行下一步實驗。
　　3)以包被原Hapten-OVA和獲得的最高效價抗體(Ab)建立

8、 IC-ELISA法。該方法對通用半抗原的IC50為9.5μg/mL,IC10為0.005μg/mL;抗體對醚菌酯和肟菌酯有較好的特異性和靈敏性,IC50分別為15.3,19.6μg/mL,IC10分別為0.0074,0.011μg/mL;但對唑菌銨酯的交叉反應率小于0.1%。結果表明該方法可作為醚菌酯和肟菌酯的酶聯免疫分析使用。
　　4)采用建立的IC-ELISA檢測柑橘樣品中醚菌酯和肟菌酯,檢測結果表明當加標濃度為100,10

9、,1μg/mL時,醚菌酯回收率分別為104.35%,95.57%,82.73%,RSD%分別為11.1%,10.8%,8.8%;肟菌酯回收率分別為92.43%,91.75%,91.10%,RSD%分別為7.4%,10.2%,10.9%,此方法符合殺菌劑痕量分析的要求。
　　4.柑橘中醚菌酯和肟菌酯的殘留規(guī)律研究用建立的QuEchERS-HPLC同步檢測方法,探討橘皮和橘肉中的醚菌酯和肟菌酯的降解規(guī)律。結果表明,儲藏12天后97%的