牡丹生根基因PsARRo-1的時(shí)空表達(dá).pdf

1、本研究在已獲得PsARRO-1基因(GQ330644) cDNA全長(zhǎng)序列的基礎(chǔ)之上，以生長(zhǎng)健壯的牡丹品種‘鳳丹白’大田植株以及腋芽誘導(dǎo)形成的無(wú)菌試管苗為供試材料，利用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)對(duì)該基因在牡丹‘鳳丹白’實(shí)生苗以及試管苗中不同時(shí)期不同部位的表達(dá)情況進(jìn)行定量分析，為進(jìn)一步研究該基因的功能奠定基礎(chǔ)。研究得到的主要結(jié)論如下:
　　1.牡丹內(nèi)參基因的篩選
　　利用q-PCR技術(shù)以及geNorm程序從β-微管蛋白(EF608942)

2、、肌動(dòng)蛋白、甘油醛-3-磷酸-脫氫酶、18S核糖體RNA(U42792)以及β-肌動(dòng)蛋白5種常用看家基因中篩選內(nèi)參基因。結(jié)果表明，β-微管蛋白基因能夠特異擴(kuò)增、顯示較高擴(kuò)增效率，并且表達(dá)最為穩(wěn)定，所以將β-微管蛋白作為牡丹實(shí)時(shí)熒光定量中的內(nèi)參基因，為定量分析提供更為精確的結(jié)果。
　　2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系的確立:
　　設(shè)置不同梯度的退火溫度(52℃、54℃、56℃、58℃、60℃)和循環(huán)數(shù)(36、38、40、42、44)

3、，采用三步法real-time PCR進(jìn)行PCR反應(yīng)體系的研究，結(jié)果表明當(dāng)退火溫度為58℃，循環(huán)數(shù)為40時(shí)，起跳位置適宜，擴(kuò)增曲線走勢(shì)正常，表達(dá)穩(wěn)定，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為單一峰值，無(wú)雜峰，表明不存在明顯的引物二聚體或非特異PCR產(chǎn)物，符合實(shí)驗(yàn)要求。所以最佳的PCR反應(yīng)體系為:95℃，2 min;再進(jìn)行95℃，15 sec與58℃，20 sec和72℃，20sec，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。
　　3 PsARRO-1基因時(shí)空表達(dá)模式的研究

4、　　對(duì)牡丹‘鳳丹白’實(shí)生苗以及試管苗的時(shí)空表達(dá)研究表明，PsARRO-1基因在實(shí)生苗以及試管苗的根、莖、葉、花中均有不同程度的表達(dá)，且實(shí)生苗中的整體表達(dá)量一般高于試管苗中的表達(dá)量。在試管苗中，莖的表達(dá)量最低，但較平穩(wěn);葉只有在誘導(dǎo)培養(yǎng)的前10d大量表達(dá);根的表達(dá)量最高，且升降明顯，出現(xiàn)兩次峰值。在實(shí)生苗中，根和莖中表達(dá)量較大，且起伏變化趨勢(shì)明顯，葉中表達(dá)量適中，花中微弱表達(dá);其中，葉和根都于取樣的第10d得到最大表達(dá)量，莖則于取樣的第3