基于FISH技術(shù)的秸稈干發(fā)酵中微生物動動態(tài)變化的研究.pdf

1、沼氣發(fā)酵是有機物在無氧環(huán)境下經(jīng)微生物分解，將其中一部分碳素物質(zhì)轉(zhuǎn)化為甲烷和二氧化碳的生物化學(xué)過程。這一過程涉及多種微生物相互協(xié)調(diào)，聯(lián)合交替，極為復(fù)雜。在不同發(fā)酵階段，微生物的種類、數(shù)量和代謝活性均有變化，各微生物種群的代謝及相互作用直接影響沼氣發(fā)酵的效率。本文研究了秸稈沼氣干發(fā)酵各階段微生物群落結(jié)構(gòu)及其動態(tài)變化規(guī)律，以及發(fā)酵溫度對干發(fā)酵過程的影響，探討了微生物群落與基質(zhì)特性之間的關(guān)系，旨在為優(yōu)化秸稈沼氣干發(fā)酵工藝，提高產(chǎn)氣效率提供理論依

2、據(jù)。
　　1.采用物理、化學(xué)以及酶處理的細胞破壁方法，提取秸稈沼氣干發(fā)酵基質(zhì)中微生物總DNA，對其純度和得率進行了比較。結(jié)果表明：采用凍融處理和酶處理相結(jié)合的破壁處理方法最為有效，DNA純度（A260/A280）和得率分別達到1.392±0.027和0.143±0.016mg/g；DNA純化試劑盒純化DNA粗提液，比吸附劑聚乙烯吡咯烷酮（PVP）純化的純度提高了34.6％，但A260/A280仍在1.8以下，未能達到利用PCR分析

3、法對微生物進行定量的要求，因此不能作為本實驗中微生物定量測定的有效方法。
　　2.優(yōu)化了熒光原位雜交技術(shù)（FISH）定量測定秸稈厭氧干發(fā)酵基質(zhì)中微生物的樣品預(yù)處理條件，并在最優(yōu)條件下做了驗證性實驗。結(jié)果表明：使用無水乙醇作為清洗液，F(xiàn)ISH樣品的熒光信號強度和豐度比用PBS清洗液（磷酸緩沖鹽溶液）時有顯著提高；樣品預(yù)處理過程中加無菌玻璃珠震蕩能提高微生物的分散度，從而提高FISH技術(shù)對秸稈厭氧發(fā)酵基質(zhì)中微生物定量的準確性；采用離心

4、轉(zhuǎn)速為13000r/min時，微生物菌體收集率提高，而且還能保證完好的細胞形態(tài)，為后續(xù)的FISH雜交奠定基礎(chǔ)。
　　3.以多聚甲醛固定時間、熱固定時間、乙醇脫水時間、雜交溫度、雜交時間為試驗因素進行二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗，對FISH定量檢測玉米秸稈厭氧干發(fā)酵基料中微生物的最佳雜交條件進行了優(yōu)化。結(jié)果表明：最佳的雜交試驗條件為多聚甲醛固定時間18h、熱固定時間15min、乙醇脫水時間3min、雜交溫度44℃、雜交時間1.5h。在該

5、試驗條件下觀察的熒光顯微圖像菌量最多，熒光信號最為強烈，且菌體分辨清晰。
　　4.研究了溫度對玉米秸稈厭氧干發(fā)酵基質(zhì)特性及微生物群落結(jié)構(gòu)變化規(guī)律的影響，探討了基質(zhì)特性與微生物群落結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系。結(jié)果表明：37℃和55℃條件下沼氣發(fā)酵啟動的均較快，乙酸化和甲烷化很快達到平衡，整個過程未出現(xiàn)明顯的酸積累，反應(yīng)體系的pH值和堿度變化較平穩(wěn)，pH始終維持在適宜甲烷化菌生長的范圍；20℃下由于甲烷化菌生長代謝緩慢，不能及時將產(chǎn)生的有機酸轉(zhuǎn)化

6、成甲烷，造成了一定的酸積累，而過度的酸積累又進一步抑制了甲烷化菌的生長繁殖和代謝，導(dǎo)致整個發(fā)酵過程中CH4含量始終處于較低水平；37℃和55℃下的微生物群落結(jié)構(gòu)有明顯差異，37℃乙酸甲烷菌數(shù)量變化較明顯，且遠遠高于氫甲烷菌的數(shù)量，而55℃下氫甲烷化菌的數(shù)量占優(yōu)勢，說明37℃和55℃下產(chǎn)生甲烷的主要菌群分別是乙酸甲烷菌和氫甲烷化菌；在發(fā)酵前期，各類甲烷化菌的數(shù)量變化不明顯，起主導(dǎo)作用的微生物是產(chǎn)酸型的細菌，它們將大分子有機物質(zhì)快速分解成小