基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)的黃瓜單性結(jié)實(shí)分子調(diào)控機(jī)理研究.pdf

1、黃瓜（CucumissativusL.）在世界各地廣泛種植，市場(chǎng)需求巨大。部分的黃瓜品種具有單性結(jié)實(shí)特性，能在不受粉的情況下正常結(jié)實(shí)，對(duì)減少人工授粉、提高黃瓜產(chǎn)量與品質(zhì)具有重要意義。許多設(shè)施黃瓜栽培品種缺乏單性結(jié)實(shí)性狀，普遍存在坐果受環(huán)境影響大、單性結(jié)實(shí)能力弱等問(wèn)題，極大地影響了黃瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)，因此選育黃瓜單性結(jié)實(shí)品種是目前重要的育種目標(biāo)之一，研究單性結(jié)實(shí)機(jī)理也成為黃瓜分子育種的熱點(diǎn)之一，發(fā)掘單性結(jié)實(shí)基因資源，對(duì)改良黃瓜栽培品種有著重

2、要的意義。本文主要以黃瓜單性結(jié)實(shí)品種‘EC1’和非單性結(jié)實(shí)品種‘8419s-1’為試材，借助RNA-Seq技術(shù)發(fā)掘與單性結(jié)實(shí)果實(shí)坐果相關(guān)的基因，利用基因瞬時(shí)表達(dá)方法對(duì)部分的黃瓜單性結(jié)實(shí)候選基因進(jìn)行快速的初步功能驗(yàn)證。另外，選取RNA-Seq分析中表達(dá)差異明顯的兩個(gè)生長(zhǎng)素受體基因CsTIR1和CsAFB2進(jìn)行深入研究，明確其在單性結(jié)實(shí)果實(shí)發(fā)育中的時(shí)空表達(dá)變化，分析外源激素對(duì)其表達(dá)水平的影響，并對(duì)CsTIR1基因進(jìn)行轉(zhuǎn)番茄(MicroTom

3、)功能驗(yàn)證。最后，本論文還分析了細(xì)胞分裂相關(guān)基因(CYCD)在單性結(jié)實(shí)果實(shí)發(fā)育早期的表達(dá)趨勢(shì)。以上研究取得了以下主要結(jié)果:
　　1.利用RNA-Seq技術(shù)發(fā)掘黃瓜單性結(jié)實(shí)調(diào)控基因及其部分候選基因的功能分析
　　選擇開(kāi)花后2天的幼果，借助RNA-Seq技術(shù)，通過(guò)比較分析，共獲得1339個(gè)與單性結(jié)實(shí)坐果相關(guān)的基因，其中759個(gè)基因在單性結(jié)實(shí)坐果中是上調(diào)的，580個(gè)基因出現(xiàn)下調(diào)。在這些差異表達(dá)的基因中，與激素相關(guān)的基因表達(dá)模式支持

4、植物激素是坐果關(guān)鍵因子的觀點(diǎn)。選取了其中的12個(gè)差異表達(dá)基因在單性結(jié)實(shí)和非單性結(jié)實(shí)果實(shí)發(fā)育的早期進(jìn)行表達(dá)水平分析，結(jié)果證明所選的基因在單性結(jié)實(shí)果實(shí)中起到重要的調(diào)控作用。
　　利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)方法對(duì)10個(gè)與生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素和赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的，且在黃瓜單性結(jié)實(shí)果實(shí)中特異表達(dá)的基因進(jìn)行功能分析。結(jié)果表明，在外源基因?qū)朦S瓜10天后，黃瓜子房，出現(xiàn)以下幾種狀態(tài):果實(shí)膨大、子房停止發(fā)育但不萎蔫、“化瓜”。利用GUSassay進(jìn)

5、行檢測(cè)，結(jié)果顯示，除在萎蔫的子房中GUS染色是陰性以外，其他兩種狀態(tài)的子房GUS染色均是陽(yáng)性，因此推測(cè)在萎蔫子房中外源基因沒(méi)有瞬時(shí)表達(dá)。所選的基因當(dāng)中，與生長(zhǎng)素信號(hào)相關(guān)的兩個(gè)基因Csa6M125240.1和Csa3M597350.1在黃瓜單性結(jié)實(shí)形成中起到了負(fù)調(diào)控作用;細(xì)胞分裂素合成相關(guān)基因Csa5M166390.1和赤霉素合成相關(guān)基因Csa3M015360.1的正向瞬時(shí)表達(dá)都可以導(dǎo)致黃瓜單性結(jié)實(shí)的形成。上述研究表明，所選的10個(gè)激素信

6、號(hào)基因能夠誘導(dǎo)單性結(jié)實(shí)的形成。
　　2.CsTIR1/AFB基因的表達(dá)分析及功能研究
　　選擇RNA-Seq中差異明顯的兩個(gè)生長(zhǎng)素受體基因進(jìn)行深入研究。結(jié)果表明，黃瓜單性結(jié)實(shí)相關(guān)的CsTIR1和CsAFB2分別在黃瓜的子葉和子房中表達(dá)量最高，在黃瓜果實(shí)發(fā)育早期其表達(dá)量隨著坐果完成逐漸下降，而在沒(méi)有成功坐果的子房中其表達(dá)量隨著子房萎蔫程度的加深逐漸上升。NAA處理后6h，CsTIR1和CsAFB2基因的表達(dá)量緩慢上調(diào)，在處理后

7、9h開(kāi)始下調(diào)，而且隨著NAA濃度從5到50μM的增加，CsTIR1和CsAFB2的表達(dá)量基本是一致的。CsTIR1在6-BA處理后3h表達(dá)量達(dá)到最大值，然后開(kāi)始下降。與CsTIR1不同，CsAFB2的表達(dá)量在6h后才開(kāi)始下降。另外，在GA3的處理下CsTIR1和CsAFB2的反應(yīng)也不一致，葉片經(jīng)GA3處理后6hCsTIR1基因表達(dá)量達(dá)到最大值，而CsAFB2基因在處理后3h到9h時(shí)間范圍內(nèi)的表達(dá)量幾乎沒(méi)有變化。ABA和乙烯利處理后，這兩

8、個(gè)基因的表達(dá)量都上調(diào)。以上結(jié)果揭示CsTIR1和CsAFB2在黃瓜果實(shí)發(fā)育的過(guò)程中起到重要的調(diào)節(jié)作用，其下調(diào)表達(dá)可能是成功坐果的關(guān)鍵;CsTIR1和CsAFB2基因?qū)ν庠醇に囟加蟹磻?yīng)，雖然是同一個(gè)家族但其反應(yīng)程度和時(shí)間不同;ABA和乙烯后其上調(diào)表達(dá)說(shuō)明這兩個(gè)基因可能參與植物的逆境過(guò)程。
　　為了研究黃瓜CsTIR1基因的功能，以番茄的子葉為外質(zhì)體，對(duì)黃瓜的CsTIR1基因進(jìn)行功能驗(yàn)證。結(jié)果表明:轉(zhuǎn)超表達(dá)CsTIR1基因的番茄出現(xiàn)單

9、性結(jié)實(shí)的現(xiàn)象，同時(shí)轉(zhuǎn)基因番茄表現(xiàn)出植株矮化特點(diǎn)。研究表明黃瓜CsTIR1基因在單性結(jié)實(shí)形成過(guò)程中起到重要的調(diào)控作用。
　　3.黃瓜果實(shí)發(fā)育調(diào)控基因CsCYCDs的克隆與表達(dá)分析
　　從RNA-Seq數(shù)據(jù)分析中，獲得關(guān)于細(xì)胞分裂的D型細(xì)胞周期蛋白家族基因(CYCD)，為研究單性結(jié)實(shí)果實(shí)發(fā)育早期的細(xì)胞分裂情況，分析了CYCD家族基因在果實(shí)發(fā)育早期的表達(dá)特征。在果實(shí)發(fā)育早期，CsCYCDs的表達(dá)趨勢(shì)表明天然單性結(jié)實(shí)果實(shí)與授粉果實(shí)細(xì)

10、胞分裂主要發(fā)生在開(kāi)花后第4天。另外，大部分CYCD基因在天然單性結(jié)實(shí)果實(shí)中的表達(dá)模式與授粉果實(shí)的一樣，但是不同于誘導(dǎo)的單性結(jié)實(shí)。以上結(jié)果表明CYCD基因家族在天然單性結(jié)實(shí)果實(shí)發(fā)育早期起著重要的調(diào)控作用，使得單性結(jié)實(shí)的子房不依賴于授粉便可以進(jìn)行果實(shí)發(fā)育所必須的細(xì)胞分裂。
　　綜上所述，黃瓜單性結(jié)實(shí)果實(shí)發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的分子調(diào)控過(guò)程。本研究發(fā)掘了黃瓜單性結(jié)實(shí)的候選基因，并對(duì)其中的部分基因進(jìn)行功能驗(yàn)證，明確了一些基因在單性結(jié)實(shí)果實(shí)發(fā)育過(guò)程