基于組學(xué)的奉節(jié)晚橙晚熟變異分子機(jī)理研究.pdf

1、拓寬柑橘成熟時(shí)期是我國(guó)柑橘產(chǎn)業(yè)當(dāng)前的迫切需求，延長(zhǎng)鮮果供應(yīng)期，可大力提高我國(guó)柑橘產(chǎn)業(yè)的競(jìng)爭(zhēng)力。柑橘屬于非躍變型果實(shí)，其果實(shí)發(fā)育和成熟調(diào)控機(jī)制依然不清楚，因此研究柑橘果實(shí)成熟分子調(diào)控機(jī)理具有重要的理論和應(yīng)用意義。本研究以‘奉節(jié)72-1'臍橙(Citrus sinensis[L.] Osbeck)及其晚熟突變體‘奉節(jié)晚橙'為研究材料，從轉(zhuǎn)錄水平、蛋白質(zhì)水平和轉(zhuǎn)錄后水平研究了這一對(duì)材料在果實(shí)成熟時(shí)期的差異。主要研究結(jié)果如下:
　　1.‘

2、奉節(jié)72-1'(WT)及其晚熟突變體‘奉節(jié)晚橙'(MT)果實(shí)采收于5個(gè)不同成熟時(shí)期，即150、170、190、210和240 DAF(花后天數(shù)，Days after flowering)。本研究測(cè)定了WT和MT在5個(gè)不同成熟時(shí)期果肉脫落酸(ABA)、可溶性糖和有機(jī)酸的含量以及果皮葉綠素含量。通過(guò)對(duì)生理數(shù)據(jù)的比較分析，發(fā)現(xiàn)170 DAF是MT和WT成熟趨勢(shì)發(fā)生差異的起始點(diǎn)，因此本研究選擇170、190和210 DAF三個(gè)連續(xù)的發(fā)育時(shí)期作為

3、重點(diǎn)研究對(duì)象，同時(shí)ABA在MT和WT之間的差異可能對(duì)MT晚熟性狀的形成有著重要的作用。
　　2.為了高效和全面的比較分析奉節(jié)72-1和奉節(jié)晚橙在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平的差異，本研究采用RNA-seq技術(shù)比較分析了MT和WT在170、190和210 DAF三個(gè)時(shí)期的轉(zhuǎn)錄表達(dá)差異;在蛋白質(zhì)水平上，采用iTRAQ技術(shù)比較分析了MT和WT在這三個(gè)時(shí)期的蛋白質(zhì)豐度差異。在轉(zhuǎn)錄水平，采用P value＜0.05、FDR≤0.001且差異倍數(shù)大于

4、兩倍的條件篩選到628個(gè)差異表達(dá)基因，其中在170、190和210 DAF三個(gè)時(shí)期分別篩選到352、270和90個(gè)差異基因，三個(gè)時(shí)期中，在MT中下調(diào)表達(dá)的基因數(shù)量大大多于上調(diào)表達(dá)的基因數(shù)量;通過(guò)KEGG代謝通路富集分析，這些差異基因被富集分布于54條不同的代謝通路（每條通路包含3個(gè)以上差異表達(dá)基因），其中在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑富集的差異基因數(shù)量是最多的，在170 DAF達(dá)到16個(gè)，其中差異最大是ABA和乙烯生物合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其次還

5、有淀粉與蔗糖代謝途徑、類胡蘿卜素合成代謝途徑等與成熟相關(guān)的路徑上也富集了不少差異基因。在蛋白質(zhì)水平，采用iTRAQ技術(shù)在MT和WT之間鑒定到130個(gè)差異蛋白質(zhì)（1.5倍以上），一些差異蛋白主要參與細(xì)胞壁代謝和檸檬酸代謝，其中還有大量的熱擊蛋白。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)大部分transcript-protein點(diǎn)落在無(wú)顯著差異象限，在轉(zhuǎn)錄水平或蛋白質(zhì)水平有差異的基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)與蛋白質(zhì)水平表達(dá)的相關(guān)性比較低，甚至有些基因在

6、這兩個(gè)水平出現(xiàn)表達(dá)相反的趨勢(shì)，所以這說(shuō)明轉(zhuǎn)錄后水平或翻譯后水平調(diào)控影響是比較大的，因此綜合轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組進(jìn)行系統(tǒng)研究是非常有必要的，這樣可以更加全面和深入的了解分子調(diào)控網(wǎng)路。
　　3.本研究在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，鑒定出了大量可能參與果實(shí)成熟調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子，一共從MT和WT中鑒定到159個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(TFs)，其中52個(gè)TFs在MT和WT之間差異表達(dá)，在WT和MT果實(shí)成熟過(guò)程中分別鑒定到92個(gè)和120個(gè)差異表達(dá)TFs，通過(guò)韋恩圖分析

7、，鑒定到在以上三個(gè)TFs集合中都有的16個(gè)TFs。這些轉(zhuǎn)錄因子主要分布于C2H2、Dof、 bHLH，、ERF、MYB、NAC和LBD轉(zhuǎn)錄因子家族，其中ERF家族轉(zhuǎn)錄因子在MT和WT之間是差異最多一類轉(zhuǎn)錄因子。通過(guò)WGCNA（加權(quán)關(guān)聯(lián)分析工具）分析，發(fā)現(xiàn)了一些與ABA、檸檬酸、果糖、葡萄糖和蔗糖相關(guān)性非常高的重要TFs，比如RD26、NTT、GATA7和MYB21/62/77等。采用層次聚類分析MT和WT之間差異表達(dá)的52個(gè)TFs，結(jié)合

8、qRT-PCR分析了16個(gè)候選TFs在MT和WT中五個(gè)果實(shí)成熟時(shí)期的表達(dá)情況，進(jìn)一步驗(yàn)證了這些TFs在果實(shí)成熟過(guò)程中的重要性。
　　4.通過(guò)對(duì)MT和WT在170 DAF時(shí)期的small RNAs及降解組的分析，一共鑒定到107個(gè)已知miRNAs，大部分都在其他物種很保守，此外還鑒定到21個(gè)新的miRNAs，大部分的新miRNAs的表達(dá)量并不低，其中在MT和WT之間差異表達(dá)的已知miRNAs有16個(gè)，新miRNAs有8個(gè)。采用降解組

9、測(cè)序，鑒定出了225個(gè)miRNAs的靶基因，這些靶基因中SPL類基因和SCL類基因占多數(shù)。靶定SPL基因的miR156、miR156k及miR157a，靶定SCL基因的miRNAs(csi-miRN19)以及靶定GAMYB的miR159都可能是柑橘果實(shí)成熟調(diào)控的關(guān)鍵因子。此外，在本研究中，還鑒定到了66個(gè)PHAS基因以及9個(gè)tasiRNAs，并且一個(gè)tasiRNA可以靶定多個(gè)PHAS基因從而產(chǎn)生大量的phasiRNAs;結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，