轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學研究海州香薷Cu吸收與耐性分子機理及其cDNA文庫的構(gòu)建.pdf

1、海州香薷(Elsholtzia splendens)為唇形科香薷屬一年生草本植物，對銅有較高的耐性和累積能力，被鑒定為銅耐性/富集植物。近年來，利用海州香薷進行Cu污染土壤的修復研究及海州香薷對銅吸收累積與耐性解毒的分子機理研究受到廣大生物和環(huán)境科學學者的關(guān)注。本論文以海州香薷為材料，采用水培試驗，運用cDNA-AFLP、實時熒光定量PCR、SDS-PAGE、2D-PAGE、MALDI-TOF MS和LTQ-ESI-MS/MS等技術(shù)，研

2、究高銅和缺銅脅迫對海州香薷轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的影響，首次從轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學的水平闡釋了海州香薷對銅吸收累積與耐性解毒的分子機理。此外，還應(yīng)用SMART技術(shù)構(gòu)建了海州香薷高銅和缺銅脅迫的全長cDNA文庫，為開展海州香薷功能基因組學研究提供了寶貴資源。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.海州香薷高Cu、缺Cu脅迫的轉(zhuǎn)錄組學研究
　　 在轉(zhuǎn)錄組學研究中，采用cDNA-AFLP技術(shù)篩選海州香薷根尖(約3～5cm)基因在缺銅(0μmo

3、l/L CuS04)和高銅(100μmol/L CuSO4)處理期間，四個時間點(0h、3h、6h和24h)基因的差異表達，獲得了66個差異表達的TDF片斷，Blast分析發(fā)現(xiàn)62個單基因，其中有43編碼已知功能蛋白，6個編碼未知功能蛋白，其余13個TDFs未能找到顯著同源的序列信息。隨機選擇5個TDFs進行實時熒光定量PCR檢測，結(jié)果與cDNA-AFLP表達譜帶所示表達趨勢一致。在62個單基因中，12個基因受高Cu脅迫的特異誘導，1個

4、基因受缺Cu脅迫的特異誘導，其余的49個基因的表達在缺Cu和高Cu處理時都受到影響。在43個已知基因中，2個參與胞內(nèi)氧化還原調(diào)控，6個與細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導有關(guān)，2個轉(zhuǎn)錄因子，1個翻譯起始因子，9個核糖體基因，3個蛋白代謝相關(guān)基因，1個能量代謝相關(guān)，9個逆境脅迫防御基因，3個金屬耐性與解毒相關(guān)基因，4個細胞壁代謝相關(guān)基因，2個次生代謝相關(guān)基因，以及1個葉主要表達蛋白基因。對這些基因在海州香薷銅吸收與耐受過程中的機制作了探討。
　　

5、2.海州香薷蛋白質(zhì)組學技術(shù)研究
　　 本研究對TCA/丙酮法、勻漿法和酚提取法三種蛋白提取方法進行比較發(fā)現(xiàn)酚提取法提取的海州香薷根、葉蛋白適于雙向電泳研究。不同pH范圍膠條的2-DE圖譜比較研究表明膠條pH值范圍為5-8時，海州香薷根、葉蛋白的2-DE分離效果最好。
　　 3.海州香薷高Cu脅迫的蛋白質(zhì)組學研究
　　 本研究發(fā)現(xiàn)100μM Cu脅迫處理6天，海州香薷根系Cu含量增加了92倍，達5170.5mg/k

6、g干重，而葉部Cu含量僅增加了3倍。對海州香薷香薷根、葉蛋白的SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，Cu處理后，海州香薷根系蛋白譜帶發(fā)生變化，而葉部蛋白的譜帶變化不大。進一步對根葉的蛋白質(zhì)組研究發(fā)現(xiàn)，Cu脅迫處理后，根系有45個蛋白點的表達發(fā)生變化，其中16個上調(diào)，29個下調(diào)；而葉部僅有6個蛋白點的表達發(fā)生變化，上調(diào)3個下調(diào)3個。對根系蛋白進行GO分析表明，這些蛋白具有多種分子功能，參與多個生物學過程，說明海州香薷的Cu耐性與解毒過程具有復雜的分子

7、機制。海州香薷根系蛋白可以分為8類：氧化還原動態(tài)平衡相關(guān)蛋白、與轉(zhuǎn)錄翻譯調(diào)控相關(guān)蛋白、信號轉(zhuǎn)導和調(diào)控相關(guān)蛋白、與能量代謝相關(guān)的蛋白、細胞壁結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白、細胞骨架相關(guān)蛋白、轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白和脅迫相關(guān)蛋白。根據(jù)這些差異表達的蛋白我們闡釋了海州香薷Cu耐性與解毒機制分子機理。
　　 4.海州香()缺Cu脅迫的蛋白質(zhì)組學研究
　　 本研究發(fā)現(xiàn)，缺Cu脅迫處理6天，海州香薷根系Cu含量下降了15.55％，而葉部Cu含量下降了25.98

8、％。SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)海州香薷根、葉的部分蛋白條帶的亮度稍有上調(diào)。進一步對根葉的蛋白質(zhì)組研究發(fā)現(xiàn)，根系有79個蛋白點的表達發(fā)生變化，其中49個上調(diào)，30個下調(diào)；葉部有14個蛋白點的表達發(fā)生變化，上調(diào)9個下調(diào)5個。對根系蛋白進行GO分析表明，這些蛋白具有多種分子功能，參與多個生物學過程，說明海州香薷對Cu的吸收過程同樣具有復雜的分子機制。根系差異表達蛋白主要參與淀粉代謝、信號轉(zhuǎn)導、氧化還原動態(tài)平衡調(diào)控、轉(zhuǎn)錄與翻譯調(diào)控、能量代謝調(diào)控、

9、蛋白質(zhì)的修飾、降解與轉(zhuǎn)運、疾病抗性、細胞壁代謝與細胞骨架調(diào)控等過程；葉部差異表達蛋白主要參與液泡離子轉(zhuǎn)運、能量代謝和碳同化，另外Rubisco蛋白降解比較明顯。這些蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)展示了海州香薷通過改變體內(nèi)生化反應(yīng)和代謝途徑來適應(yīng)缺Cu脅迫的分子機理。
　　 對海州香薷高銅和缺銅脅迫時根、葉的蛋白質(zhì)組學研究結(jié)果表明根系在Cu的吸收耐性與解毒機制中具有重要的意義，可能起到Cu庫的作用。海州香薷適應(yīng)缺銅和高銅脅迫時，能夠誘導一些類似功

10、能的蛋白，諸如氧化還原調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)錄與翻譯調(diào)控、能量代謝調(diào)控、細胞壁代謝與細胞骨架調(diào)控、離子轉(zhuǎn)運等相關(guān)的蛋白，但這些蛋白在兩種脅迫時處理Cu離子的機理不盡相同。
　　 5.海州香薷高Cu、缺Cu脅迫根cDNA文庫的構(gòu)建
　　 本研究分別以缺銅和高銅處理3h、6h和24h的海州香薷根尖為建庫材料，采用SMART技術(shù)首次構(gòu)建了海州香薷缺銅和高銅脅迫的cDNA文庫。缺銅脅迫cDNA原始文庫滴度為1.22E+08 pfu/