早晚熟油菜成花機(jī)理的初步研究.pdf

1、油菜是主要的油料作物之一，也是較理想的冬季作物，在中國已經(jīng)形成油菜和水稻輪作的栽培模式，但現(xiàn)在推廣的甘藍(lán)型油菜品種生育期較長，影響了后茬水稻的栽培，而且高溫或雨季等不良?xì)夂蛞草^大影響了晚熟品種的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，選育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的早熟新品種就顯得尤為重要，這也是當(dāng)前我國油菜育種的主要目標(biāo)之一。油菜開花時(shí)間是決定其成熟期早晚的一個(gè)重要指標(biāo)，而開花作為植物從營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在植物的一生中起著非常重要的作用，因而對(duì)其機(jī)理進(jìn)行研究

2、是十分有意義的。雖然人們對(duì)植物成花機(jī)理的研究已有一百多年，但目前仍然沒有形成一套系統(tǒng)的、適用于各種植物的理論，因而需要對(duì)更多植物包括油菜進(jìn)行成花機(jī)理的系統(tǒng)研究。
　　 本文主要研究內(nèi)容有：(1)以RG-8M(甘藍(lán)型油菜晚熟品種RG-8的早熟突變體)、‘福油-4’(中晚熟品種)和RG-8為試驗(yàn)材料，研究不同熟性油菜成花過程中的生理生化變化；(2)以RG-8M為材料，通過cDNA末端快速克隆(RACE)技術(shù)，克隆油菜成花相關(guān)基因LE

3、AFY(LFY)和CONSTANS(CO)，并初步檢測它們?cè)诓煌l(fā)育時(shí)期和不同器官的表達(dá)情況；(3)以RG-SM、‘福油-4’和RG-8為材料，運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對(duì)三種春化和未春化油菜葉片的蛋白質(zhì)進(jìn)行了差異分析。主要的研究結(jié)果如下：
　　 1.成花期間三個(gè)油菜品種葉片中的淀粉含量總體呈快速下降的趨勢，(α+β)-淀粉酶(主要是β-淀粉酶)活性及可溶性糖含量則呈上升的趨勢，說明淀粉可通過淀粉酶等水解為可溶性糖類物質(zhì)，使油菜中可利

4、用的碳水化合物增多，從而有利于油菜成花。成花期間油菜葉片中的還原糖和果糖含量總體呈上升趨勢，說明高水平的還原糖、果糖可能是作為結(jié)構(gòu)物質(zhì)或能源物質(zhì)對(duì)油菜的成花起促進(jìn)作用。在成花的多數(shù)時(shí)期，RG-8M可溶性糖、還原糖和果糖的含量明顯低于‘福油-4’和RG-8，說明相對(duì)較低的這些糖含量有利于油菜提早成花。蔗糖含量及與之呈負(fù)相關(guān)的酸性轉(zhuǎn)化酶活性在不同油菜品種的成花過程中表現(xiàn)不一，可能與蔗糖不僅僅是能量供應(yīng)物而是一種信號(hào)物質(zhì)有關(guān)，而成花期間RG-

5、8M酸性轉(zhuǎn)化酶的高活性表現(xiàn)可能是它更早成花所需要的。
　　 2.成花期間三個(gè)油菜品種葉片中的可溶性蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量在開始花芽分化之前水平較低，之后則呈不同程度上升的趨勢，說明低水平的可溶性蛋白質(zhì)、游離氨基酸有利于油菜花芽分化的啟動(dòng)，而高水平的可溶性蛋白質(zhì)、游離氨基酸可為油菜花芽形態(tài)分化和發(fā)育提供物質(zhì)保證，滿足其營養(yǎng)要求，從而有利于油菜成花。三個(gè)油菜品種的對(duì)比說明，適量的高水平可溶性蛋白質(zhì)、游離氨基酸含量有利于RG-SM提早

6、成花?；ㄑ啃螒B(tài)分化期間油菜葉片中的核酸(主要是RNA)總量和DNA含量均同時(shí)增加，說明這個(gè)階段有旺盛的DNA復(fù)制、RNA合成過程，可促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，從而有利于油菜花芽分化。與‘福油-4’和RG-8相比，RG-SM花芽分化期間更多的RNA含量與更高的RNA/DNA表明，它可能有一個(gè)更旺盛的核酸指導(dǎo)下的蛋白質(zhì)合成過程，所合成的特殊蛋白質(zhì)與酶類促使其更早花芽分化。成花期間不同油菜品種的RNase、DNase活性變化趨勢各不相同，但都是在現(xiàn)蕾

7、期之前保持低水平的狀態(tài)，說明這個(gè)階段核酸的分解代謝較弱，合成代謝占據(jù)著主導(dǎo)地位，這對(duì)油菜的花芽分化是有利的。
　　 3.成花期間三個(gè)油菜品種葉片中的GA3含量在花芽分化始期之前下降，之后上升的趨勢表明，低含量的GA3有利于油菜花芽分化的起始，而高含量的GA3有利于油菜花芽形態(tài)分化及發(fā)育。對(duì)油菜成花過程中另外三種激素的研究表明，低含量的IAA和高含量的ABA、ZR有利于油菜的花芽分化。成花期間RG-8M每種激素含量總體低于‘福油-

8、4’和RG-8的現(xiàn)象說明，相對(duì)較低的激素水平有利于油菜提早成花。另外，高比值的ABA/GA3、ZR/GA3可促進(jìn)油菜的花芽分化，特別有利于花芽分化的起始，而較高的ABA/IAA比值與較低的ZR/ABA比值有利于油菜整個(gè)的成花過程。成花期間與IAA含量呈負(fù)相關(guān)的IAAO活性總體呈上升的趨勢，與IAA含量變化趨勢相反，說明較高的IAAO活性有利于油菜的花芽分化，IAAO是油菜成花過程中分解IAA的主要酶類。而與IAA含量相關(guān)程度不高的POD

9、在花芽分化始期之前呈上升趨勢，說明POD活性的升高有利于油菜花芽分化的起始，其對(duì)花芽分化的影響并不完全靠氧化IAA來實(shí)現(xiàn)，而成花期間RG-8M POD相對(duì)的高活性表現(xiàn)可能是它更早成花所需要的。
　　 4.成花期間三個(gè)油菜品種葉片中的PAs(主要是Put和Spd)含量在花芽分化始期之前呈下降的趨勢，之后開始上升，而且不同品種上升的趨勢及到達(dá)峰值的時(shí)間有較大差異，RG-8M的上升幅度大于‘福油-4’和RG-8，到達(dá)峰值的時(shí)間也更早。

10、可見，較低含量的PAs有利于油菜花芽分化的起始，含量的增加有利于花芽形態(tài)分化及發(fā)育，越早熟的品種其體內(nèi)PAs含量越早到達(dá)較高水平。PAO活性的變化趨勢與PAs總量的變化較一致，它們之間呈極顯著正相關(guān)，說明高的PAO活性也是有利于成花的。成花期間三個(gè)油菜葉片中的綠原酸含量變化總體呈下降的趨勢，說明較低的綠原酸水平是有利于油菜成花的，而且在花芽分化過程中越早熟的油菜品種所需的綠原酸相對(duì)含量越高。
　　 5.根據(jù)已知的LFY同源基因保

11、守區(qū)序列設(shè)計(jì)簡并引物，以RG-8M基因組DNA為模板，克隆到了油菜的LFY同源基因片段，再根據(jù)獲得的同源基因片段設(shè)計(jì)特異性引物，采用RACE技術(shù)獲得了油菜中LFY同源基因BnLFY的全長cDNA序列。該基因cDNA全長為1310bp，包含一個(gè)長為1248bp的開放閱讀框(ORF)，編碼415個(gè)氨基酸，其推測的氨基酸序列具有其他雙子葉植物L(fēng)FY類蛋白特有的區(qū)域，即N端的脯氨酸富集區(qū)、中央的酸性區(qū)、亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)以及富含賴氨酸與精氨酸的堿性

12、區(qū)，這是一些轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特征。該氨基酸序列與幾種十字花科植物L(fēng)FY類蛋白的氨基酸序列同源性高達(dá)85％以上。RT-PCR技術(shù)對(duì)該基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況研究表明，BnLFY基因在油菜中為組成型表達(dá)，其表達(dá)無發(fā)育時(shí)期和組織特異性。
　　 6.采用克隆BnLFY基因的方法，獲得了油菜中CO同源基因BnCO的全長cDNA序列。該基因cDNA全長為1348bp，包含一個(gè)長為1281bp的ORF，編碼426個(gè)氨基酸，其推測的氨基酸序列具有完整的

13、植物CO類蛋白的結(jié)構(gòu)，含有高度保守的B-box型鋅指結(jié)構(gòu)域和CCT結(jié)構(gòu)域，說明它編碼的是一個(gè)完整的轉(zhuǎn)錄因子，由于含有兩個(gè)完整的B-box結(jié)構(gòu)，故屬于CO基因家族的第一類。BnCO基因編碼的氨基酸序列與與油菜、芥藍(lán)、黑芥和白芥的同源性較高，尤其是3’端和5’端，與油菜BnCoal、Bn9CON10和Bn1CON19蛋白的同源性幾乎為100％，因此推測這些區(qū)域是該基因功能作用的必需區(qū)域。盡管BnCO基因與前人克隆出的油菜CO同源基因同源性較

14、高，但該基因編碼的蛋白在中間部位多出一段含60個(gè)氨基酸的序列，推測BnCO基因是油菜CO基因家族里的不同于它們的另一個(gè)成員。RT-PCR技術(shù)對(duì)該基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況研究表明，BnCO基因在油菜中為組成型表達(dá)，其表達(dá)無發(fā)育時(shí)期和組織特異性。
　　 7.通過比較分析三種春化油菜和未春化油菜葉片的蛋白質(zhì)圖譜，共找出27個(gè)差異蛋白質(zhì)，其中6個(gè)是三個(gè)品種所共有的。對(duì)這些差異蛋白質(zhì)進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF/MS

15、)及數(shù)據(jù)庫檢索分析，共成功鑒定了其中的22個(gè)蛋白質(zhì)。鑒定的蛋白質(zhì)根據(jù)功能的不同可以分為光合作用相關(guān)蛋白(45％)、能量代謝相關(guān)蛋白(14％)、抗氧化作用相關(guān)蛋白(9％)、蛋白質(zhì)和氨基酸代謝相關(guān)蛋白(14％)、逆境抗性相關(guān)蛋白(14％)和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白(5％)_6個(gè)主要類群。其中核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)、Rubisco大亞基、推定的光系統(tǒng)Ⅰ第三類葉綠素a/b結(jié)合蛋白以及磷酸丙糖異構(gòu)酶不但與油菜的春化作用密切相關(guān)