黃瓜果實(shí)發(fā)育調(diào)控的分子機(jī)理研究.pdf

1、瓜類蔬菜是全世界范圍內(nèi)普遍栽培的重要作物，在生產(chǎn)上和消費(fèi)上占有重要地位。它們多屬雌雄異花同株植物，生產(chǎn)上尤其是設(shè)施栽培中的低溫，弱光和高濕等因素很容易造成授粉受精不良，導(dǎo)致“化瓜”或者“畸形瓜”現(xiàn)象的產(chǎn)生，進(jìn)而影響農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。因此，研究瓜類果實(shí)的座果和發(fā)育過程及其調(diào)控機(jī)制有助于加深我們對(duì)果實(shí)發(fā)育的理論認(rèn)識(shí)，也有利于切實(shí)地解決生產(chǎn)中所存在的問題。本文以黃瓜(Cucumis　sativus L．)栽培品種津春2號(hào)和4號(hào)為試材，研究了果實(shí)發(fā)

2、育中細(xì)胞分裂，核內(nèi)復(fù)制，細(xì)胞膨大的時(shí)空變化，分析了這些過程的分子調(diào)控基礎(chǔ)及植物生長(zhǎng)物質(zhì)對(duì)其的影響。研究了BRs在果實(shí)發(fā)育中的作用和分子依據(jù)，在此基礎(chǔ)上，研究了BRs對(duì)幼果RNA轉(zhuǎn)錄本的影響。同時(shí)，還研究了BRs和細(xì)胞分裂素在果實(shí)發(fā)育中對(duì)多胺代謝的影響。所得主要結(jié)果如下： 1.研究了細(xì)胞分裂、核內(nèi)復(fù)制及細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)在黃瓜果實(shí)發(fā)育中的變化及植物生長(zhǎng)物質(zhì)對(duì)其的影響。結(jié)果表明，細(xì)胞分裂在開花后4天(DAA)內(nèi)非常旺盛，然后逐漸減

3、慢到8 DAA基本停止。核內(nèi)復(fù)制從4 DAA開始，伴隨果實(shí)重量的增加而增加。核內(nèi)復(fù)制的出現(xiàn)結(jié)合果實(shí)快速增長(zhǎng)的開始表明果實(shí)中細(xì)胞膨大從開花后4 DAA開始，對(duì)果實(shí)不同部位的研究表明，核內(nèi)復(fù)制主要發(fā)生在內(nèi)果皮和果肉中。在6個(gè)細(xì)胞周期相關(guān)基因(CycA，CycB，CycD3；1，CycD3；2，CDKA和CDKB)中，兩個(gè)分裂相關(guān)的周期蛋白基因(CycA和CycB)以及CDKB在2 DAA內(nèi)表達(dá)水平達(dá)到最高，而CycD3和CDKA的最高表達(dá)分

4、別在4 DAA和20 DAA。奈乙酸(NAA)，N-(2-氯-4-吡啶基)-N'-苯基脲(CPPU)和表油菜素內(nèi)酯(EBR)都能誘導(dǎo)黃瓜單性結(jié)實(shí)，加快細(xì)胞分裂和提高細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)。相對(duì)而言，赤霉素(GA3)不能誘導(dǎo)單性結(jié)實(shí)，其對(duì)細(xì)胞分裂和細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)作用也很小。 2.研究了擴(kuò)張蛋白(expansin)和木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移／水解酶(XTHs)家族基因在黃瓜果實(shí)發(fā)育中的作用及其對(duì)植物生長(zhǎng)物質(zhì)的響應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大部分

5、expansin基因(CsExp3，5，6，7，8，9和10的最高表達(dá)都出現(xiàn)在果實(shí)的快速細(xì)胞膨大期，表明這些基因在細(xì)胞膨大期起重要作用。CsExp1,4和XTH基因在分裂旺盛的果實(shí)發(fā)育前期表達(dá)較高，從而推測(cè)其在細(xì)胞分裂中的細(xì)胞壁修復(fù)和重建過程起重要作用。同時(shí)，這兩個(gè)家族的大部分基因都在內(nèi)果皮或者果肉中表達(dá)較高，也同樣證明了它們?cè)诩?xì)胞膨大中的作用。不同expansin和XTH基因?qū)λ姆N不同的植物生長(zhǎng)物質(zhì)(NAA，EBR，CPPU和GA3)

6、有著每個(gè)基因獨(dú)特的響應(yīng)機(jī)制。 3.研究了油菜素內(nèi)酯(BRs)在果實(shí)發(fā)育中的重要作用。在非單性結(jié)實(shí)的津春4號(hào)黃瓜栽培品種的子房上添加EBR可以誘導(dǎo)單性結(jié)實(shí)并且提高細(xì)胞分裂能力，而在單性結(jié)實(shí)的津春2號(hào)黃瓜栽培品種的子房上噴施BRs合成抑制劑(Brz)抑制果實(shí)生長(zhǎng)，最終導(dǎo)致敗育，而這種抑制現(xiàn)象可以通過添加EBR得以恢復(fù)。通過PCR克隆的方法，我們得到了CsCycD3；1和CsCycD3；2的cDNA序列，通過Northern雜交的方法

7、發(fā)現(xiàn)，CscycD3；1和CsCycD3;2的轉(zhuǎn)錄水平受EBR處理上調(diào)而強(qiáng)烈地被Brz處理抑制。同時(shí)，BR6ox1和SMT(BRs合成相關(guān)基因)呈現(xiàn)反饋調(diào)節(jié)模式，從一定程度上說明了果實(shí)發(fā)育中BRs含量的變化。 4.在BRs對(duì)黃瓜幼果RNA轉(zhuǎn)錄本影響的研究過程中，構(gòu)建了黃瓜子房受EBR處理之后的消減抑制雜交(SSH)文庫，共獲得600個(gè)陽性克隆，在測(cè)序所得的132個(gè)cDNA序列中包含了118個(gè)非重復(fù)基因，根據(jù)BLASTX分析推測(cè)這

8、些基因編碼的蛋白功能，可以分為光合作用，蛋白合成，細(xì)胞分裂和分化，細(xì)胞膨大，代謝，脅迫響應(yīng)和其它相關(guān)的7大類，其中參與細(xì)胞分裂調(diào)控的基因占最大比例，表明BRs參與調(diào)節(jié)了果實(shí)發(fā)育的多個(gè)過程，主要以調(diào)控細(xì)胞分裂為主。生長(zhǎng)素和赤霉素響應(yīng)基因在SSH文庫中的出現(xiàn)，表明BRs可能與其它植物生長(zhǎng)物質(zhì)互作，共同作用于果實(shí)發(fā)育。14-3-3蛋白的出現(xiàn)，并且被EBR處理的高水平上調(diào)表明了14-3-3蛋白的信號(hào)途徑可能在果實(shí)發(fā)育中起了重要作用。 5

9、.研究了多胺代謝在黃瓜果實(shí)發(fā)育中的變化模式以及BRs和CPPU對(duì)其的調(diào)控。結(jié)果表明，自由態(tài)多胺的含量和多胺合成酶基因的表達(dá)在果實(shí)發(fā)育前期較高，并且，多胺在細(xì)胞分裂旺盛的外果皮中分布較多，說明多胺主要在黃瓜果實(shí)發(fā)育的細(xì)胞分裂期起作用。在EBR和CPPU誘導(dǎo)的果實(shí)生長(zhǎng)過程中，多胺的含量和基因的表達(dá)在發(fā)育早期也被顯著提高，說明BRs和細(xì)胞分裂素在誘導(dǎo)果實(shí)生長(zhǎng)過程中調(diào)節(jié)了內(nèi)源多胺的代謝。此外，我們推測(cè)未授粉子房中多胺含量的保持和合成基因的高水平