CRIP在文蛤與方形網(wǎng)紋溞發(fā)育過(guò)程中的功能.pdf

1、文蛤和方形網(wǎng)紋溞都是水產(chǎn)上十分重要的動(dòng)物，前者是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)品種之一，后者常作為魚(yú)類(lèi)的活體餌料。這兩種生物都很少用于分子生物學(xué)的研究。本研究利用分子生物學(xué)手段研究了這2種無(wú)脊椎動(dòng)物的富含半胱氨酸小腸蛋白（Cysteine-richintestinalprotein,CRIP）基因，初步探討了CRIP在它們體內(nèi)的生物學(xué)功能。
　　本研究分為2個(gè)部分。第1部分對(duì)文蛤的CRIP基因的克隆與功能展開(kāi)研究，具體的研究結(jié)果如下：
　　

2、（1）克隆了文蛤的CRIP的cDNA序列，長(zhǎng)度為468bp，其中ORF237bp，5’非翻譯區(qū)83bp，3’非翻譯區(qū)148bp。
　?。?）對(duì)MmCRIP（Meretrixmeretrixcysteine-richintestinalprotein）進(jìn)行生物信息學(xué)分析。MmCRIP編碼一條由78個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，分子式為C379H578N106O110S8，理論分子量為8635.8。其中富含Lys（13.92%）、Gly（1

3、1.39%）和Cys（8.86%），缺乏Gln、Ile。含有負(fù)電氨基酸殘基7個(gè)，正電氨基酸殘基13個(gè)，等電點(diǎn)為9.01，屬于陽(yáng)離子多肽。MmCRIP具有CRIP亞家族特征性結(jié)構(gòu)域——LIM結(jié)構(gòu)域。蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)其在碳末端和氮末端分別形成α-螺旋與連續(xù)的兩個(gè)β-折疊。
　　（3）利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)檢測(cè)了MmCRIP在不同發(fā)育階段、不同組織中mRNA的表達(dá)差異。結(jié)果顯示，擔(dān)輪幼蟲(chóng)和D型幼蟲(chóng)階段MmCRIP表達(dá)量較

4、低，而在從D型幼蟲(chóng)變態(tài)成殼頂幼蟲(chóng)時(shí)表達(dá)量升高，后者是前者的3.5倍。此外，在殼頂幼蟲(chóng)到稚貝的發(fā)育過(guò)程中MmCRIP表達(dá)量略有下降。在不同組織中，肌肉中MmCRIP的表達(dá)量最高（P≤0.05，n=3）。
　?。?）利用qPCR技術(shù)檢測(cè)MmCRIP受鰻弧菌刺激后mRNA表達(dá)量的變化。結(jié)果表明菌刺激前后MmCRIP表達(dá)量保持穩(wěn)定。
　?。?）用不同濃度MmCRIP的雙鏈RNA（dsRNA）對(duì)文蛤D型幼蟲(chóng)進(jìn)行RNA干擾。結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.

5、1、1.0、10μg/mLdsRNA處理組死亡率均顯著高于對(duì)照組（P≤0.01，n=6）。處理濃度越大的dsRNA，使得D型幼蟲(chóng)存活數(shù)目下降得越快。三個(gè)濃度的處理組均在處理48h后，死亡率接近100%。
　　結(jié)論是，認(rèn)為MmCRIP可能參與文蛤從D型幼蟲(chóng)到殼頂幼蟲(chóng)的發(fā)育過(guò)程。MmCRIP在成貝肌肉組織中有高表達(dá)，提示其可能主要在肌肉組織中發(fā)揮重要生理功能。
　　第二部分的內(nèi)容是方形網(wǎng)紋溞的CqCRIP基因的克隆和功能分析，具

6、體的研究結(jié)果如下：
　?。?）克隆了方形網(wǎng)紋溞的CRIP的cDNA序列，長(zhǎng)度為693bp，其中ORF237bp，3’非翻譯區(qū)456bp。
　?。?）對(duì)CqCRIP（Ceriodaphniaquadrangulacysteine-richintestinalprotein）進(jìn)行生物信息學(xué)分析。CqCRIP所編碼多肽由78個(gè)氨基酸殘基組成，分子式為C378H576N110O108S8，理論分子量為8645.8。其中富含Lys（1

7、2.66%）、Gly（11.39%）和Cys（8.86%），缺乏Ile。含有負(fù)電氨基酸殘基6個(gè)，正電氨基酸殘基12個(gè)，等電點(diǎn)為9.04，屬于陽(yáng)離子多肽，同MmCRIP一樣具有CRIP家族所擁有的LIM結(jié)構(gòu)域。蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，亦在碳末端和氮末端分別形成α-螺旋與連續(xù)的兩個(gè)β-折疊。基于CRIP氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，MmCRIP與CqCRIP與無(wú)脊椎動(dòng)物CRIP聚類(lèi)在一起。
　?。?）利用qPCR檢測(cè)CqCRIP在不同發(fā)育

8、階段mRNA的表達(dá)差異。結(jié)果顯示各齡期的表達(dá)量基本恒定，但在食物趨于短缺、水質(zhì)下降的環(huán)境下產(chǎn)生的雄體中CqCRIP的mRNA表達(dá)量顯著地大于雌體（P≤0.01，n=3）；產(chǎn)休眠卵的雌體的表達(dá)量大于正常孤雌生殖雌體（P≤0.05，n=3）。
　?。?）用含有CqCRIPdsRNA的HT115菌投喂方形網(wǎng)紋溞，死亡率相較于對(duì)照顯著上升（P≤0.05，n=3），尤其是60-72h時(shí)為極顯著（P≤0.01，n=3）。但84h后總死亡率不大