組胺在網(wǎng)紋藤壺幼蟲附著變態(tài)過程中的作用.pdf

1、隨著人們對海洋資源的開發(fā)利用，海洋生物污損所造成的損失越來越嚴(yán)重，研究開發(fā)對環(huán)境無毒無害、高效的傳統(tǒng)毒性涂料替代品成為人們關(guān)注的話題。海洋中的污損生物種類繁多，其中藤壺是海洋污損生物中最具代表性的一種，對環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)性，是海洋污損生物的重要物種。目前尋找無毒抗污損活性化學(xué)品的研究已廣泛開展，基于的原理有抑制附著、抑制變態(tài)、干擾神經(jīng)或傳導(dǎo)等。
　　本文針對網(wǎng)紋藤壺幼蟲的附著變態(tài)問題，首先通過實(shí)驗(yàn)室模擬的方法，建立實(shí)驗(yàn)室幼蟲附著變

2、態(tài)測試模型。包括尋找出幼蟲的最適生長環(huán)境，對幼蟲的附著變態(tài)進(jìn)行初步的研究。其次，利用前期研究發(fā)現(xiàn)的從海洋放線菌Streptomyces fungicidicus的代謝產(chǎn)物中分離鑒定出兩個(gè)flavone類化合物，測定了其抗藤壺幼蟲附著的活性，并驗(yàn)證該活性測試模型。結(jié)果表明，genistein具有較好的抗幼蟲附著活性。同時(shí)，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)mizolastine的功能類似物（H1受體拮抗劑）對幼蟲的附著變態(tài)有一定的影響。所以，本文主要從miz

3、olastine的功能類似物著手，進(jìn)行抗幼蟲附著變態(tài)的實(shí)驗(yàn)研究，篩選出最優(yōu)的抗污損活性化合物，闡明組胺在藤壺幼蟲附著變態(tài)中的作用。本文的主要研究結(jié)果如下:
　　(1)實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，網(wǎng)紋藤壺適合生長在水溫約22℃以上的環(huán)境中，溫度過低時(shí)，不利于網(wǎng)紋藤壺的繁殖和生長。網(wǎng)紋藤壺產(chǎn)卵受精后，受精卵發(fā)育到無節(jié)幼蟲后才能完成孵化，無節(jié)幼蟲的個(gè)體較小，對環(huán)境的適應(yīng)能力相對較差。實(shí)驗(yàn)室中，通過不同環(huán)境的比較，選出適于無節(jié)幼蟲(nauplii)的

4、生長環(huán)境，使無節(jié)幼蟲(nauplii)變態(tài)為金星幼蟲(cyprid)在約6d內(nèi)完成，該過程在恒溫環(huán)境（28℃±1℃）中進(jìn)行，用角毛藻喂養(yǎng)。
　　(2)根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的mizolastine可以阻止藤壺生物幼蟲的附著變態(tài)，根據(jù)其作為組胺信號分子受體拮抗劑的功能，篩選出35種信號分子受體干擾物質(zhì)，并對此35種信號干擾物質(zhì)進(jìn)行幼蟲的附著變態(tài)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)了8種優(yōu)良的無毒的抗污損活性化合物，在2.5μg ml-1濃度下可完全抑制幼蟲

5、的附著變態(tài)。它們分別是:Loratadine、Ondansetronhydrochloride、Antazoline hydrochloride、Clemastine fumarate、Triprolidine hydrochlorise、Azelastine hydrochloride、Propranolol hydrochloride和Clorprenaline hydrochloride。這些優(yōu)良的無毒抗污損活性化合物的抗污損效果

6、接近或超過現(xiàn)實(shí)應(yīng)用的傳統(tǒng)毒性抗污損化合物，而毒性低于傳統(tǒng)毒性抗污損化合物10-100倍。除了此8種優(yōu)選物質(zhì)外，還有4種活性較強(qiáng)的（Risperidone、Ketotifen fumarate、Tegaserod maleate和Clenbuterol hydrochloride）和6種有一定活性的抗污損活性化合物(Amitriptyline hydrochloride、Promethazinehydrochloride、Phenylep

7、hrine hydrochloride、Phentolamine Mesylate、Diphenhydraminehydrochloride和Lafutidine），它們分別可以在5μg ml-1及5-10μg ml-1濃度下完全抑制幼蟲附著。從實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，8種最優(yōu)抗污損活性化合物中有5種為組胺H1受體拮抗劑(Loratadine、Antazoline hydrochloride、Clemastine fumarate、Triproli

8、dine hydrochlorise和Azelastine hydrochloride)，故推測活性產(chǎn)生的原因可能和干擾histamine信號途徑有關(guān)系。
　　(3)8種最優(yōu)的抗污損活性化合物的深入研究。針對8種最優(yōu)的抗污損活性物質(zhì)，進(jìn)行了不同濃度處理?xiàng)l件下的幼蟲附著變態(tài)情況的研究。根據(jù)不同濃度下的幼蟲附著變態(tài)受抑制程度和處理濃度的關(guān)系，計(jì)算出每個(gè)樣品的EC50值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，此8種活性物質(zhì)的EC50分別為:Loratadine

9、:EC50＜0.625μg ml-1; Ondansetron hydrochloride:EC50=1.52μgml-1; Antazoline hydrochloride: EC50＜0.625μg ml-1; Clemastine fumarate: EC50＜0.2μg ml-1;Triprolidine hydrochlorise: EC50=0.91μg ml-1; Azelastine hydrochloride: EC5

10、0＜0.2μg ml-1;Propranolol hydrochloride: EC50=0.73μg ml-1; Clorprenaline hydrochloride: EC50=0.72μg ml-1。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)這些樣品在20μg ml-1的濃度下對幼蟲的致死率幾乎沒明顯貢獻(xiàn)，說明這些化合物為高效低毒的具有應(yīng)用潛力的抗污損活性化臺物。
　　(4)驗(yàn)證histamine參與幼蟲的附著變態(tài)的信號傳導(dǎo)。由于前述實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)多個(gè)組胺受體

11、的拮抗劑高效抑制幼蟲的附著變態(tài)，所以，本文還對組胺是否參與幼蟲的附著變態(tài)進(jìn)行了驗(yàn)證。驗(yàn)證內(nèi)容主要分成三個(gè)部分:第一，正常狀態(tài)的幼蟲體內(nèi)是否含有組胺，這也是組胺參與幼蟲生理活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ);第二，外源添加組胺是否可以促進(jìn)幼蟲的附著變態(tài)過程;第三，原本受信號干擾物質(zhì)關(guān)閉組胺信號通路的幼蟲，在新鮮環(huán)境中或增加histamine信號強(qiáng)度，可否完成附著變態(tài)過程。通過HPLC-Fr分析發(fā)現(xiàn)，在nauplii幼蟲和cyprid幼蟲體內(nèi)均含有histam

12、ine。因此這兩種不同發(fā)育階段的幼蟲均有了使用histamine作為信號傳遞載體的物質(zhì)基礎(chǔ)。在nauplii幼蟲變態(tài)為cyprid幼蟲的過程中，外源添加10-8、10-10、10-12 mol/L的histamine均可以有效減短培育時(shí)間，并提高變態(tài)率。其中，10-10 mol/L的濃度處理效果最為顯著。而且本文培養(yǎng)了一種低能量的cyprid幼蟲，由于自身存儲(chǔ)的能量較少，原本能完成正常的附著變態(tài)的能力較弱。通過外源加入histamine

13、，發(fā)現(xiàn)加入的組胺可促進(jìn)幼蟲的附著變態(tài)。添加的histamine的最適濃度為5×10-9 mol/L，高于或低于這一濃度時(shí)，對幼蟲附著變態(tài)的促進(jìn)作用明顯減弱。最后，本文還設(shè)計(jì)了一種恢復(fù)實(shí)驗(yàn)，即先用組胺受體拮抗劑抑制組胺信號，發(fā)現(xiàn)幼蟲不能完成附著變態(tài)過程;然后將處理的幼蟲清洗后，分成兩組放入含有5×10-9 mol/L histamine或新鮮海水中，比較在新環(huán)境中的幼蟲完成附著變態(tài)的情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，histamine可有效解除原本hi