生物技術(shù)畢業(yè)論文--紅掌組培快繁過程中污染原因的分析及對策探討

1、<p>　　畢業(yè)設(shè)計（論文）任務(wù)書</p><p>　　一、題目： 紅掌組培快繁過程中污染原因的分析及對策探討 </p><p>　　二、本環(huán)節(jié)自2009年6月30日起至20010年 6月30日</p><p>　　三、進行地點： 四、

2、內(nèi)容要求： 綜述簡練完整，有見解；立論正確，論述充分，結(jié)論嚴謹合理，實驗正確，分析處理科學(xué)；文字通順 ，技術(shù)用語準確，符號統(tǒng)一，編號齊全，書寫工整規(guī)范，圖表完備、整潔、正確；論文結(jié)果有應(yīng)用價值。 </p><p>　　指導(dǎo)教師： 職稱 </p><p>　

3、　批準日期： 年 月 日</p><p>　　紅掌組培快繁過程中污染原因的分析及對策探討</p><p><b>　　摘 要</b></p><p>　　紅掌（拉丁名：Spathiphyllum floribundum），亦叫安祖花，紅鶴芋等，天南星科火燭屬。其花色艷麗，花莖挺拔，葉型翠綠美觀，是當今世界著名的切花和盆栽花

4、卉之一，市場潛力大，具有極高的觀賞價值和經(jīng)濟價值。紅掌的繁殖方法通常采用分株繁殖、扦插繁殖和組織培養(yǎng)繁殖。但分株繁殖、扦插繁殖很難滿足當前市場的需求，組織培養(yǎng)是紅掌快速繁殖的有效途徑。由于組織培養(yǎng)中經(jīng)常出現(xiàn)不同程度的污染問題，造成很大的損失，因此控制污染是植物組織培養(yǎng)苗工廠化生產(chǎn)中重要的技術(shù)環(huán)節(jié)。本文從滅菌方法、內(nèi)源性污染、繼代培養(yǎng)中污染防治等方面，進行了紅掌組培快繁過程中污染原因的分析及對策的探討。</p><p&

5、gt;　　關(guān)鍵詞：紅掌，組織培養(yǎng)，滅菌，污染，防治</p><p>　　Andraeanum during tissue culture analysis of the causes of pollution and related countermeasures</p><p><b>　　ABSTRACT</b></p><p>　　Ant

6、hurium, also called Andrew Flower, lines such as flamingo, a Fire Araceae. Its bright colors, tall and straight stem, green leaf-type appearance, are well-known in today's world of cut and potted flowers, one large m

7、arket potential, with high ornamental value and economic value. Flower andraeanum breeding methods commonly used ramets propagation, cutting propagation and tissue cultur e propagation. However, ramets propagation, cutti

8、ng propagation is difficult to meet current market demand, ti</p><p>　　KEY WORDS: Anthurium，tissue culture， sterilization， pollution，prevention and treatment</p><p><b>　　目　錄</b></

9、p><p><b>　　前　言1</b></p><p>　　第1章 培養(yǎng)基的滅菌2</p><p>　　1.1一般培養(yǎng)基的滅菌2</p><p>　　1.2不耐熱物質(zhì)的滅菌2</p><p>　　第2章 外植體材料的消毒與滅菌4</p><p>　　2.1外植體的消

10、毒與滅菌4</p><p>　　第3章 接種前的準備工作5</p><p>　　3.1器皿、工具的滅菌5</p><p>　　3.1.1器皿與金屬器械的滅菌5</p><p>　　3.1.2布質(zhì)制品的滅菌5</p><p>　　3.2培養(yǎng)室的滅菌5</p><p>　　3.3無菌操作

11、和無菌操作技術(shù)5</p><p>　　第4章 紅掌誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)過程中的污染7</p><p>　　第5章 污染的原因和預(yù)防措施8</p><p><b>　　5.1通常污染8</b></p><p>　　5.2內(nèi)源性污染8</p><p>　　5.3污染原因判斷及污染苗搶救8<

12、/p><p>　　5.4預(yù)防方法和措施9</p><p>　　5.4.1基本方法9</p><p>　　5.4.2經(jīng)常檢查消毒鍋的滅菌質(zhì)量9</p><p>　　5.4.3檢查培養(yǎng)容器是否存在問題10</p><p>　　5.4.4繼代培養(yǎng)中污染的控制10</p><p>　　5.4.5減

13、少培養(yǎng)基中的有機成分10</p><p><b>　　結(jié)　論11</b></p><p><b>　　謝 辭12</b></p><p><b>　　參考文獻13</b></p><p><b>　　附　錄15</b></p>&

14、lt;p><b>　　外文資料翻譯18</b></p><p><b>　　前　言</b></p><p>　　紅掌（拉丁名：Spathiphyllum floribundum），天南星科火燭屬，原產(chǎn)地哥倫比亞。其花色艷麗，花莖挺拔，葉型翠綠美觀，是當今世界著名的切花和盆栽花卉之一，市場潛力大，具有極高的觀賞價值和經(jīng)濟價值。其繁殖方法通常

15、采用分株繁殖、扦插繁殖和組織培養(yǎng)繁殖。但分株繁殖、扦插繁殖很難滿足當前市場的需求，組織培養(yǎng)是安祖花快速繁殖的有效途徑。</p><p>　　植物組織培養(yǎng)中經(jīng)常會出現(xiàn)不同程度的污染問題，污染是在組織培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。它是影響植物組織培養(yǎng)的一個重要因素，它通常會導(dǎo)致培養(yǎng)失敗造成很大的損失。植物組培苗的工廠化生產(chǎn)在我國發(fā)展速度很快，組織培養(yǎng)技術(shù)日趨完善，但在組織培養(yǎng)中通常會出現(xiàn)不同

16、程度的污染，因此預(yù)防和控制污染是植物組織培養(yǎng)苗工廠化生產(chǎn)中重要的技術(shù)環(huán)節(jié)。在植物組織培養(yǎng)過程中，存在兩種類型的污染：一類是通常所說的污染，即外植體消毒不徹底，無菌操作和培養(yǎng)過程中，如：培養(yǎng)基、接種工具、接種室消毒不嚴格或操作不規(guī)范而導(dǎo)致的污染；另一類是內(nèi)源菌污染，內(nèi)源菌包括真菌和細菌，內(nèi)源污染一般是指內(nèi)源細菌所致的污染。</p><p>　　本文從一般的污染的控制、內(nèi)源性污染的控制、繼代培養(yǎng)中污染防治、減少培養(yǎng)基

17、中的有機成分等方面，討論了怎樣減少組培中出現(xiàn)的污染問題，如：對于一般的污染來說，主要從操作環(huán)境、操作人員、儀器；對于內(nèi)源性污染主要是從外植體預(yù)處理到外植體滅菌方法；對于繼代培養(yǎng)污染的控制主要是從對無菌外植體進行檢驗和反復(fù)進行莖尖培養(yǎng)或分生組織培養(yǎng)；至于對培養(yǎng)基有機成分的減少措施主要是減去培養(yǎng)基中的VB1、VB6或除去培養(yǎng)基中的蔗糖這幾方面加以論述。</p><p>　　第1章 培養(yǎng)基的滅菌</p>

18、<p>　　1.1一般培養(yǎng)基的滅菌</p><p>　　培養(yǎng)基是在有菌的環(huán)境中配制的，在該過程中會使培養(yǎng)基帶有各種雜菌，因此，每次培養(yǎng)基配制完畢和分裝后應(yīng)盡快滅菌，否則培養(yǎng)基中就會滋生各種雜菌，改變培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分和pH值，影響培養(yǎng)效果。常用滅菌方法是用高壓蒸汽滅菌法進行滅菌，將培養(yǎng)基置于高壓滅菌鍋中，從達到要求溫度的時刻算起，在0.105Mpa的壓力下（121。C）滅菌15-40min。滅菌的時間取決

19、于溫度，而不是直接取決于壓力。由于容器的體積不同，瓶壁的厚度不同，所需滅菌時間也不同[1]（表1-1），對經(jīng)過高壓滅菌后不會變質(zhì)的物品，如無菌水、培養(yǎng)皿、器械等，可延長滅菌時間和增加壓力。培養(yǎng)基滅菌時間不能過長，否則容易引起培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的損失，并且瓊脂也會隨滅菌時間的延長，凝固能力下降，甚至不能凝固。因此，所需的滅菌時間應(yīng)隨著要進行滅菌的物體體積而變化。</p><p>　　表1-1 培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌所必須

20、的最少時間</p><p>　　當滅菌鍋里的熱溶液冷卻時，必須十分小心，如果壓力下降過急，超過了溫度下降的速率，就會使液體滾沸，從培養(yǎng)容器之中溢出。另外，只有當高壓鍋的壓力表指針回到零時，才能打開滅菌鍋。</p><p>　　1.2不耐熱物質(zhì)的滅菌</p><p>　　某些生長調(diào)節(jié)物質(zhì)（GA3、Zt、IAA、IBA）、尿素以及某些維生素等不耐熱的物質(zhì)遇熱易分解，不能

21、進行高壓蒸汽滅菌處理，通常只能采用單獨液體過濾滅菌方法。熱分解化合物溶液的滅菌是通過過濾膜進行過濾滅菌的，然后將其加入經(jīng)過高壓滅菌過的并未凝固的培養(yǎng)基中。</p><p>　　如果是制備固態(tài)培養(yǎng)基，方法是先將沒有不耐熱物質(zhì)而包含其他化合物的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)瓶中進行高壓蒸汽滅菌，滅菌后置于超凈工作臺上冷卻。當其冷卻至45。C左右（即瓊脂凝固溫度），瓊脂將要凝固之前，加入經(jīng)過濾滅菌的各項不耐熱成分的溶液，然后混勻放置，

22、待冷涼凝固后備用，但不能在瓊脂培養(yǎng)基溫度較高時加入，以防止不耐熱物質(zhì)的分解[2]。</p><p>　　第2章 外植體材料的消毒與滅菌</p><p>　　2.1外植體的消毒與滅菌</p><p>　　1、用紅掌莖尖作外植體時，要盡量選取帶菌少的材料，如果室外栽培的材料污染太嚴重，可先將植物樣本挖出，改為室內(nèi)盆栽，噴布殺蟲劑和殺菌劑，不便移栽的，可套塑料袋，待長出新

23、枝條后，再行采樣接種。</p><p>　　2、對污染嚴重的外植體，可以在培養(yǎng)基中加入殺菌劑。也可在菌類長入組織內(nèi)部時，除去韌皮組織，只接種內(nèi)部的分生組織可防止材料帶菌。</p><p>　　3、外植體消毒常用藥劑有：70%～75%的酒精，0.3%～0.6%的次氯酸鈉溶液和0.1%的升汞溶液等。選用何種滅菌劑和滅菌時間根據(jù)不同情況及操作者的經(jīng)驗來掌握，既要求將外植體表面的微生物徹底殺死，又

24、要求盡可能少傷害外植體組織和表層細胞。先用75%的酒精棉花擦拭外植體材料再使用消毒藥劑常能取得較好的消毒效果[3]。常用消毒劑的消毒效果比較見表2-1:</p><p>　　表2-1 常用消毒劑的消毒效果比較</p><p>　　第3章 接種前的準備工作</p><p>　　3.1器皿、工具的滅菌</p><p>　　3.1.1器皿與金屬器械

25、的滅菌</p><p><b>　　1、玻璃器皿的滅菌</b></p><p>　　可采用濕熱滅菌法，即將玻璃器皿包扎后置入蒸汽滅菌器中進行高溫高壓滅菌，滅菌時間可長到25～30min。也可采用干熱滅菌法，即將玻璃器皿置入電熱烘箱中進行滅菌；還可以把玻璃器皿放入水中煮沸滅菌[4]。</p><p><b>　　2、金屬器械的滅菌<

26、;/b></p><p>　　一般用火焰滅菌法，即把金屬器械放在95%的酒精中浸一下，然后放在火焰上灼燒滅菌。這一步在無菌操作中有要反復(fù)進行。</p><p>　　3.1.2布質(zhì)制品的滅菌</p><p>　　工作人員使用的工作服、帽子、口罩等，要經(jīng)常保持干凈，并定期進行消毒。采用濕熱滅菌法，即將洗凈晾干的布質(zhì)品放人高壓滅菌器中在壓力0.11～0.12Mpa，

27、溫度121℃下滅菌20～30min[5]。</p><p><b>　　3.2培養(yǎng)室的滅菌</b></p><p>　　每次接種前應(yīng)對接種室的地面進行清潔衛(wèi)生工作，并用75%的酒精噴霧使空氣中的灰塵沉降，并用紫外燈照射20～30min。接種前工作臺面要用新潔爾滅或75%酒精擦洗,使用超凈工作臺對接種環(huán)境污染的控制更有成效。但它應(yīng)置放在潔凈的房間，窗戶密封，并定期清洗過

28、濾膜，以延長使用壽命。培養(yǎng)室的相對濕度應(yīng)控制在70%左右，相對濕度太高可以用抽濕機除濕。接種結(jié)束后，應(yīng)進行地面清潔衛(wèi)生工作，即先打掃一遍，再用濕布擦過，并定期用甲醛熏蒸接種室。</p><p>　　3.3無菌操作和無菌操作技術(shù)</p><p>　　植物組織培養(yǎng)是一種無菌技術(shù)，因此不僅要求整個操作過程，一切用具、材料、培養(yǎng)基、培養(yǎng)室、工作人員的衣物都要無菌，而且要求工作人員在操作過程中要遵守

29、無菌操作的規(guī)程，如少有疏忽，都會造成無法挽回的后果，使工作前功盡棄。污染中特別注意一種呈乳白色的細菌污染，這種細菌為芽孢桿菌。法國林木育種協(xié)會鑒定為遲緩芽孢桿菌，它外被莢膜，耐高溫，一般消毒劑難以殺死。它可隨培養(yǎng)材料、用具等傳播；也可出現(xiàn)在培養(yǎng)基表面，或呈滴形云霧狀存在培養(yǎng)基內(nèi)，若出現(xiàn)時應(yīng)嚴格滅菌，清洗和消毒用具，并更換消毒酒精[6]。</p><p>　　操作人員操作動作要熟練、動作快、規(guī)范，這樣可以縮短操作時

30、間，減少污染。因為有很多組織培養(yǎng)的失敗，從材料、培養(yǎng)基條件等方面檢查均無問題，只是由于操作技術(shù)不熟練，如脫毒培養(yǎng)抽取莖尖很小，操作時間長了就會使莖尖失水變干，或不慎感染雜菌，再同時接種的環(huán)境又不是絕對無菌的。所以工作人員在進行無菌操作是要嚴守以下幾點：</p><p>　　1、入無菌室前，要洗手，去掉指甲中的污物。</p><p>　　2、入室時要穿上經(jīng)過消毒的工作服、帽子、口罩和鞋子等。

31、</p><p>　　3、操作前要用70% 的酒精擦洗工作人員的手，操作中要經(jīng)常用酒精擦洗手。不準講話，亦不準對著操作區(qū)呼吸，以免微生物污染材料、培養(yǎng)基和用具。每次重新操作都要把工具在火焰上消毒。</p><p>　　4、必須在酒精燈火焰處進行操作，如打開瓶口，轉(zhuǎn)接材料。蓋瓶蓋前應(yīng)將瓶口在火焰上燒一下，再將蓋子也在火焰上燒一下，然后蓋上。</p><p>　　第4章

32、 紅掌誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)過程中的污染</p><p>　　初代培養(yǎng)獲得的無菌材料在后期或繼代培養(yǎng)也可能出現(xiàn)污染，這一方面是由于操作不慎的原因，另外即是由于初代培養(yǎng)中使用了營養(yǎng)相對簡單的培養(yǎng)基有可能使污染不易表現(xiàn)出來，有時繼代材料在培養(yǎng)室則可能被螨傳播的真菌污染。</p><p>　　對已污染的紅掌組培苗，有時因植物材料難得或重新發(fā)生要花費很多時間，也可切取較大的植株重新消毒接種。李春燕等用40

33、0或600萬單位/L的青霉素?zé)o菌水溶液分別浸泡紅掌組培細菌污染苗60min或40min，可有效防治組培中的細菌污染。經(jīng)處理過的苗繼代培養(yǎng)時，不再重復(fù)出現(xiàn)細菌污染現(xiàn)象，且苗分化能力強，生根培養(yǎng)時，根系發(fā)達，移栽成活率高[7]。李穎等的實驗研究證明，如果繼代培養(yǎng)中只有真菌污染，采用3%的多菌靈無菌液浸泡0.5h以上即可，用無菌水沖洗后接種或不用無菌水沖洗直接接種都可消除真菌污染。如果在細菌污染和細菌、真菌同時污染的情況下，可采用 HgCl2

34、消毒法，把污染的紅掌培養(yǎng)苗切割成較長的莖段作外植體，用自來水沖洗0.5h，再在超凈工作臺上用乙醇和HgCl2進行短時間的處理即可再度建立無菌苗培養(yǎng)體系[8]。</p><p>　　第5章 污染的原因和預(yù)防措施</p><p><b>　　5.1通常污染</b></p><p>　　在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)材料附近經(jīng)常出現(xiàn)黏液或混濁的水跡，并有發(fā)酵狀泡

35、沫。這大多是細菌性污染，主要是由于使用了未消毒好的工具及操作者呼吸時排出的細菌所引起的，或是操作人員的手接觸了材料或器皿邊緣所致；有時培養(yǎng)基上還會出現(xiàn)黃、白、黑等不同顏色的霉菌，這是真菌性污染，主要是由于接種室空氣污染造成的[9]</p><p><b>　　5.2內(nèi)源性污染</b></p><p>　　在紅掌組織培養(yǎng)中，由于材料內(nèi)部的內(nèi)生菌不能被一般的表面消毒方法所

36、清除，隨著材料進入培養(yǎng)過程，引起的污染稱為內(nèi)生性污染或內(nèi)源性污染。主要有以下幾類：黃單胞菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、土壤桿菌屬、棒狀桿菌屬、歐文氏菌屬等。真菌主要有霉菌。</p><p>　　在紅掌初代培養(yǎng)中，表面細菌引起的污染通常在2～3天就能在外植體周圍或培養(yǎng)基表面形成明顯的如水污狀、油污狀、氣泡或干縮的紅、黃、乳白等顏色的菌落。而在外植體培養(yǎng)后3～5天內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)細菌污染，以后則不段出現(xiàn)明顯的或不明顯的細菌

37、菌落，就可能是由內(nèi)生細菌引起的污染[10]。在紅掌初代培養(yǎng)或前幾代的繼代培養(yǎng)中存在的污染，并不形成明顯的菌落而只在培養(yǎng)基內(nèi)部形成“絲狀物”，“暈狀物”，不易被肉眼發(fā)現(xiàn)的，對紅掌中的內(nèi)生細菌，由于它潛伏得較深，表面消毒方法無法將其消滅。有時在外植體的初級培養(yǎng)中，包括前幾代的繼代培養(yǎng)，往往在培養(yǎng)基上不易被發(fā)現(xiàn)，隨著繼代培養(yǎng)次數(shù)的增加，菌量不斷的積累，就會在培養(yǎng)基上表現(xiàn)出來。對于這種情況，我們可以利用背光檢查法去觀察發(fā)現(xiàn)它[11]。</

38、p><p>　　5.3污染原因判斷及污染苗搶救</p><p>　　1、若污染菌類是零星分散在培養(yǎng)基中，則可確定是人為引起的污染，比如培養(yǎng)基滅菌不徹底；超凈工作臺長時間不換濾網(wǎng)，致使凈化能力降低；接種用具滅菌不徹底；操作不正確，動作生硬緩慢，開瓶時間太久，接種臺擺放物品雜亂，操作中心在人體范圍之內(nèi)；接種室長期不滅菌，菌類太多；若污染菌類是從材料周圍長起，則可證明是植物材料帶菌引起?？赡苁墙臃N用

39、具滅菌不徹底，接種時材料被污染；或者是未及時發(fā)現(xiàn)污染苗，接種過程交叉感染；若是外植體，菌類從材料培養(yǎng)基以上部分長起，而不是從培養(yǎng)基先長起，且發(fā)生在5天以后，則說明是材料帶的內(nèi)生菌。若從培養(yǎng)基以下開始長菌，發(fā)生時間較早，且有從里向外的趨勢，則說明是切口引起的污染，原因有是滅完菌后，未剪去兩個切口或雖剪但器具帶菌[12]。</p><p>　　2、真菌污染后，如果已形成孢子，則必須經(jīng)高壓滅菌后扔掉，即使僅形成菌絲，菌

40、絲能夠達到材料內(nèi)部，因此，真菌污染是滅絕性的。但若使細菌污染，由于細菌繁殖是靠芽孢，細菌不會彌散整個空間，因此只要及時發(fā)現(xiàn)，將材料上部未感菌的部分剪下轉(zhuǎn)接，材料仍可以用。</p><p>　　3、用抗生素等殺菌藥劑的處理，雖有不少報道，但至今還未發(fā)現(xiàn)那種抗生素能夠?qū)Ω鞣N菌都有效，并且常常也會影響紅掌材料的正常生長分化。另一些藥劑，雖有的殺菌效果好，但往往容易引起鹽害，也無法利用[13]。</p>&

41、lt;p>　　5.4預(yù)防方法和措施</p><p><b>　　5.4.1基本方法</b></p><p>　　1、通風(fēng)：經(jīng)常開窗，保持室內(nèi)空氣流通．可以使室內(nèi)真菌數(shù)量減少。通風(fēng)方法簡便易行，應(yīng)多使用。</p><p>　　2、去濕：保持室內(nèi)空氣干燥，如使用空調(diào)“除濕”功能，也可減少真菌生長繁殖。</p><p>

42、　　3、光照：紫外線能殺滅或抑制真菌生長，有調(diào)查發(fā)現(xiàn)下午一時是大氣細菌粒子沉降的一個低谷，說明太陽輻射對空氣微生物有明顯的殺滅作用。因此，保持室內(nèi)較好采光，在梅雨季節(jié)后將衣物等晾曬，對減少室內(nèi)真菌污染大有好處[14]。</p><p>　　4、防霉：污染物品和污染培養(yǎng)基不要在培養(yǎng)室近距離開瓶洗刷。</p><p>　　5.4.2經(jīng)常檢查消毒鍋的滅菌質(zhì)量</p><p&g

43、t;　　消毒鍋的壓力表降到零后不能馬上出鍋。因冷熱空氣作用的負壓效應(yīng)，使外界環(huán)境的冷空氣倒吸入已滅菌好的培養(yǎng)瓶內(nèi)引起真菌污染，為避免該現(xiàn)象的發(fā)生，消毒后培養(yǎng)瓶應(yīng)留在鍋里，等冷卻后才出鍋。如果出現(xiàn)培養(yǎng)基造成的污染，就要及時地檢查滅菌鍋的性能或其他的問題。</p><p>　　5.4.3檢查培養(yǎng)容器是否存在問題</p><p>　　培養(yǎng)容器封口多用塑料蓋、膠塞、棉塞、薄膜等，塑料蓋用久了易老化

44、，密封性差，也會造成污染。同時，培養(yǎng)瓶在使用之前要洗凈（包括瓶內(nèi)瓶外），滅好菌的培養(yǎng)瓶不要放在空氣中太久，一般出鍋后1～2天內(nèi)接完種最好，以減少培養(yǎng)瓶表面的微生物引起的污染。</p><p>　　5.4.4繼代培養(yǎng)中污染的控制</p><p>　　這類污染可以從以下2個方面進行防止。(1)擴大繁殖時應(yīng)有合理程序。在獲得的無菌培養(yǎng)物之后，應(yīng)將其中一部分作為“原種”保存起來，分批繁殖和復(fù)檢后再

45、大規(guī)模生產(chǎn)。（2）可通過在培養(yǎng)基中加入抗菌劑來防止。多菌靈用于紅掌組織培養(yǎng)的抑菌促生長，培養(yǎng)物不受微生物污染，滅菌率為98%以上，無白化苗，生長健壯，不過這種方法不能廣泛使用，因為有些植物在抑菌素會受到毒害，如葉片變小、變黃和不能分化等。還有使用時要調(diào)到適合的濃度[16]。</p><p>　　5.4.5減少培養(yǎng)基中的有機成分</p><p>　　培養(yǎng)基中有機成分的存在是污染產(chǎn)生的重要原因

46、,去除有機物是減少污染的一條途徑。在紅掌的組織培養(yǎng)中，除去培養(yǎng)基中的VB1、VB6、煙酸等（保留肌醇）有機成分，經(jīng)2～3代培養(yǎng)后，能抑制細菌生長，對叢生芽生長增殖沒有影響。原因是這些都是某些細菌生長的必須物質(zhì)，去除這些有機成分后，細菌無法生長發(fā)育而慢慢死亡或減少。由日本的古在豐樹教授首創(chuàng)的無糖組織快繁技術(shù)則全部除去培養(yǎng)基中的有機成分，輸入可控制量的CO2氣體作為碳源，并通過控制環(huán)境因子，促進植株光合作用速率，使之由異養(yǎng)型轉(zhuǎn)變成自養(yǎng)型，因

47、而植物長勢良好，污染率明顯降低[17]。</p><p><b>　　結(jié)　論</b></p><p>　　污染問題，是紅掌組織培養(yǎng)過程中難以杜絕的現(xiàn)象。污染造成的后果是嚴重的，它會增加接種源及污染的幾率，對花卉造成傷害，耗工耗時，提高生產(chǎn)成本。對于如何控制污染，以建立一個潔凈、良好的工作與培養(yǎng)環(huán)境和無菌的植株系統(tǒng)為組培業(yè)所要努力的方向。</p><

48、p>　　目前組培苗污染實驗所遇到的問題為不易建立植株的干凈度，因此無法確定真正的污染源來自何處，無法對癥下藥。而且對于菌種的鑒定有很大的困難，因為一般有關(guān)植物或是植物病原菌，其背景資料較少，對于鑒定而言，便較棘手。在紅掌組織培養(yǎng)中，一般的污染較容易控制，要達到接種的無菌環(huán)境條件，無菌操作要求和無菌操作水平。而內(nèi)源菌則較難控制，要求全部殺死植物表面和組織中的微生物，一般的消毒方法是不能完成的。通過先對外植體植物進行預(yù)栽管理、外植體的

49、預(yù)處理，并在這基礎(chǔ)上，改進消毒方法，（如真空減壓法、酸化培養(yǎng)基、灼燒法等），也可除去培養(yǎng)基中的有機成分，這些措施都能降低由內(nèi)源菌引起的污染。當然，在植物組織培養(yǎng)中，控制污染的方法是可靈活多變的，只要能減少污染，不會發(fā)生培養(yǎng)物的遺傳變異，實現(xiàn)工廠化快繁，降低成本，能在市場競爭中占有一席之地即可。</p><p><b>　　謝 辭</b></p><p>　　本課題在

50、選題及研究過程中得到趙老師的悉心指導(dǎo)。并為我指點迷津，幫助我開拓研究思路，精心點撥、熱忱鼓勵。</p><p>　　本文從材料的收集到撰都是在趙老師和同學(xué)們的關(guān)心和鼓舞下順利進行的。在這期間盡管趙老師很忙但它卻仍然抽出時間為我修改論文，使我能夠順利的將本文完成。同學(xué)們也不亦樂乎的為我提供幫助，他們積極的為我查資料并相互檢查錯誤共同提高。在我的寫作過程中，趙老師多次指導(dǎo)我論文的寫作方法和技巧，教我研究的思路和方向。

51、在我寫作論文的期間，每當我遇到困難和疑惑時，趙老師總是一針見血的指出我的不足，幫助我撥開迷霧、跨越困難的鴻溝。趙老師始終為人師表，不厭其煩，令我感到無比欽佩。本文是在趙老師的精心指導(dǎo)下完成的，在此我謹向趙老師致以崇高的敬意。</p><p>　　最后，不能忘記我的兄弟姐妹們——我的同學(xué)和朋友們，在論文寫作的過程中乃至三年的學(xué)習(xí)生活里，他們與我朝夕相處，互相討論，共同進步。在此我忠心的向所有幫助過我的老師和同學(xué)表示

52、感謝！</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1]李云.林果花菜組織培養(yǎng)快速育苗技術(shù)，中國林業(yè)出版社，2003，1（2）:23-25</p><p>　　[2]王青連.植物組織培養(yǎng)[M]，中國農(nóng)業(yè)出版社，2002：23-24.</p><p>　　[3]周俊輝.植物組織快繁技術(shù)中存在的問題和

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57、業(yè)科學(xué)，2002(11):47-48</p><p>　　[16]宋鋒惠,李康,史彥江.組織培養(yǎng)及快速繁殖技術(shù)研究，新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，39(6)：343-345</p><p>　　[17]肖玉蘭.植物無糖組培快繁工廠化生產(chǎn)技術(shù)，云南科技出版社，2003，3(2):1-4</p><p><b>　　附　錄 </b></p>

58、<p><b>　　滅菌方法</b></p><p>　　常用的滅菌方法可分為物理的和化學(xué)的兩類，即：物理方法如干熱(烘燒和灼燒)、濕熱(常壓或高壓蒸煮)、射線處理(紫外線、超聲波、微波)、過濾、清洗和大量無菌水沖洗等措施；化學(xué)方法是使用升汞、甲醛、過氧化氫、高錳酸鉀、來蘇兒、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒精化學(xué)藥品處理。這些方法和藥劑要根據(jù)工作中的不同材料不同目的適當選用濕熱滅菌

59、（培養(yǎng)基）培養(yǎng)基在制備后的24h內(nèi)完成滅菌工序。</p><p>　　1、高壓滅菌方法是最常用的物理滅菌方法，高壓滅菌的原理是：在密閉的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸氣不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加。在0.1MPa的壓力下，鍋內(nèi)溫度達121 ℃。在此蒸氣溫度下，可以很快殺死各種細菌及其高度耐熱的芽孢。注意完全排除鍋內(nèi)空氣，使鍋內(nèi)全部是水蒸氣，滅菌才能徹底。高壓滅菌放氣有幾種不同的做法，但目的

60、都是要排凈空氣，使鍋內(nèi)均勻升溫，保證滅菌徹底。常用方法是：關(guān)閉放氣閥，通電后，待壓力上升到O．05MPa時，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再關(guān)閉放氣閥。三次放氣后，關(guān)閥再通電，壓力表上升達0．1～0．15Mpa時，維持15～20min。對高壓滅菌后不變質(zhì)的物品，如無菌水、栽培介質(zhì)、接種用具，可以延長滅菌時間或提高壓力。而培養(yǎng)基要嚴格遵守保壓時間，既要保壓徹底，又要防止培養(yǎng)基中的成分變質(zhì)或效力降低，不能隨意延長時間。對于一些布

61、制品，如實驗服、口罩等也可用高壓滅菌。洗凈晾干后用耐高壓塑料袋裝好，高壓滅菌20～30min。高壓滅菌前后的培養(yǎng)基，其pH值下降0.2～0.3單位。高壓后培養(yǎng)基pH值的變化方向和幅度取決于多種因素。在高壓滅菌前用堿</p><p>　　從而改變培養(yǎng)基的滲透壓。在8%～20%蔗糖范圍內(nèi)，高壓滅菌后的培養(yǎng)基約升高0.43倍。培養(yǎng)基中的鐵在高壓滅菌時會催化蔗糖水解，可使15%～25%的蔗糖水解為葡萄糖和果糖。培養(yǎng)基值小

62、于5.5，其水解量更多，培養(yǎng)基中添加0.1%活性炭時，高壓下蔗糖水解大大增強，添加1%活性炭，蔗糖水解率可達5%。</p><p>　　2、灼燒滅菌（用于無菌操作的器械）在無菌操作時，把鑷子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前在酒精燈火焰上灼燒滅菌。冷卻后，立即使用。操作中可采用250或500ml的廣口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。</p><p>　　3、干熱滅菌（玻璃器皿

63、及耐熱用具）干熱滅菌是利用烘箱加熱到160～180。C的溫度來殺死微生物。由于在干熱條件下，細菌的營養(yǎng)細胞的抗熱性大為提高，接近芽孢的抗熱水平，通常采用170 ℃持續(xù)90min來滅菌。干熱滅菌的物品要預(yù)先洗凈并干燥，工具等要妥為包扎，以免滅菌后取用時重新污染。包扎可用耐高溫的塑料。滅菌時應(yīng)漸進升溫，達到頂定溫度后記錄時間。烘箱內(nèi)放置的物品的數(shù)量不宜過多，以免妨礙熱對流和穿透，到指定時間斷電后，待充分冷涼，才能打開烘箱，以免因驟冷而使器皿

64、破裂。干熱滅菌能源消耗太大，浪費時間。</p><p>　　4、過濾滅菌（不耐熱的物質(zhì)）一些生長調(diào)節(jié)劑，如赤霉素、玉米素、脫落酸和某些維生素是不耐熱的，不能用高壓滅菌處理，通常采用過濾滅菌方法?？捎脽o菌的孔徑0.20～0.45um的硝酸纖維素膜過濾菌類，當溶液通過濾膜后，細菌的細胞和真菌的孢子等因大于濾膜直徑而被阻，在需要過濾滅菌的液體量大時，常使用抽濾裝置；液量小時，可用注射器。使用前對其高壓滅菌，將濾膜裝在注

65、射器的靠針管處，將待過濾的液體裝入注射器，推壓注射器活塞桿，溶液壓出濾膜，從針管壓出的溶液就是無菌溶液。</p><p>　　5、紫外線和熏蒸滅菌（空間）</p><p>　　(1)紫外線滅菌在接種室、超凈臺上或接種箱里用紫外燈滅菌。紫外線滅菌是利用輻射因子滅菌，細菌吸收紫外線后，蛋白質(zhì)和核酸發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，引起細菌的染色體變異，造成死亡。紫外線的波長為200～300nm，其中以260nm的

66、殺菌能力最強，但是由于紫外線的穿透物質(zhì)的能力很弱，所以只適于空氣和物體表面的滅菌，而且要求距照射物以不超過120 cm為宜。</p><p>　　(2)熏蒸滅菌用加熱焚燒、氧化等方法，使化學(xué)藥劑變?yōu)闅怏w狀態(tài)擴散到空氣中，以殺死空氣和物體表面的微生物。這種方法簡便，只需要把消毒的空間關(guān)閉緊密即可。常用熏蒸劑是甲醛，熏蒸時，房間關(guān)閉緊密，按5～8ml/m3用量，將甲醛置于廣口容器中，加5 g/m3高錳酸鉀氧化揮發(fā)。熏

67、蒸時，房間可預(yù)先噴濕以加強效果。冰醋酸也可進行加熱熏蒸，但效果不如甲醛?；瘜W(xué)消毒劑的種類很多，它們使微生物的蛋白質(zhì)變性，或競爭其酶系統(tǒng)，或降低其表面張力，增加菌體細胞漿膜的通透性，使細胞破裂或溶解。一般說來，溫度越高，作用時間越長，殺菌效果越好。另外，由于消毒劑必須溶解于水才能發(fā)揮作用，所以要制成水溶狀態(tài)，如升汞與高錳酸鉀。還有消毒劑的濃度一般是濃度越大，殺菌能力越強，但石炭酸和酒精例外。</p><p>　　6

68、、噴霧滅菌（物體表面）物體表面可用一些藥劑涂擦、噴霧滅菌。如桌面、墻面、雙手、植物材料表面等，可用70%的酒精反復(fù)涂擦滅菌，l%～2%的來蘇兒溶液以及0.25%～1%的新潔爾滅也可以。</p><p><b>　　外文資料翻譯</b></p><p>　　CHITOSAN on andraeanum tissue inhibition of bacteria</

69、p><p>　　contamination</p><p>　　Abstract: The fungi was isolated and purified from polluted anthurium subculture medium, identified to be DeuteromycotinaHyphpmycetes Hyphomycetales Dematiaceae and t

70、richoderma. The inhibition effect of the three kinds of chitosan on the fungi wasconducted.The results showed that the chitosan had inhibition effect on the fungi. The higher concentrations of chitosan had a betteinhibit

71、ion effect than the lower ones.The inhibition effect of 50000 and 250000 molecular weight chitosan is better than </p><p>　　Key words: tissue culture; contamination; Chitosan; inhibition effect </p>&

72、lt;p>　　Plant tissue culture, not only in plant breeding, rapid propagation of seedlings and the production of useful secondary metabolites, such as the use of a wide range of plant genetic engineering is and Plant Mol

73、ecular Biology, one of the important foundation for the study [1]. Pollution, browning, glass and tissue culture are the main problems, including pollution of the most common [2]. Therefore take effective prevention and

74、control measures to reduce the chance of contamination occurred, tissu</p><p>　　1 Materials and Methods 1.1 Test materials 1.1.1 Isolates Streptomyces bacteria pollution (code-named WCHPA), separated

75、from the laboratory contamination andraeanum subculture medium. 1.1.2 Test for Drugs Chitosan, a Zhejiang Xing Biotechnology Australia Limited, a molecular weight of 3kd (degree of deacetylation> 80%), 50kd (deg

76、ree of deacetylation> 90%), 25kd (degree of deacetylation> 90%)[6]. 1.1.3 Medium PDA medium Potatoes 200g, glucose 20g, agar 20g, distilled water 1000m</p><p>　　Qiu-ping [11], The results show tha

77、t the antimicrobial effect of chitosan with its concentration increases, the experimental results support the results of the study. A wide range of applications of chitin, chitosan in the medical, food, environmental pro

78、tection, in areas such as chemical products have wide-ranging and important applications. Chitosan flowers will be used for tissue culture would be very good prospects.</p><p>　　References</p><p&g

79、t;　　[1]MK.Razdan. Zun-Xiao-an, ZHU Yang translation. Introduction to Plant Tissue Culture [M]. Beijing: Chemical Industry Press ,2006:1-2. </p><p>　　[2]Hu, ZHANG Li-jun,baixuemei, et al. Plant Tissue Cu

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87、gloeosporioides, Diplodia antagonism bacteria [J]. Food and machinery, 2005,21, (1) :25-27.</p><p>　　殼聚糖對紅掌組培污染菌的抑制作用</p><p>　　摘要：在污染的紅掌繼代培養(yǎng)基中提取污染菌并進行了分離及純化，初步鑒定為為半知菌亞門（Deuteromycotin

88、a),絲孢綱（Hyphpmycetes),絲孢目（Hyphomycetales）,淡色孢科（Dematiaceae）,木霉屬（trichoderma）。研究了殼聚糖對該菌的抑制作用，探索了3種分子量及其6種濃度的殼聚糖對該菌的抑制效果。結(jié)果表明：殼聚糖對該污染菌有抑制作用，5 萬和 25 萬分子量的抑菌效果高于 3000 分子量，濃度越高，抑菌效果越好。初步證實了殼聚糖對組培污染菌類有很好的抑制作用，在花卉組織培養(yǎng)污染防治方面具有應(yīng)用價

89、值。 </p><p>　　關(guān)鍵詞：組織培養(yǎng)；污染；殼聚糖；抑制作用 </p><p>　　植物組織培養(yǎng)不僅在植物育種、 苗木快速繁殖和有用次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)等方面應(yīng)用廣泛，也是植物基因工程和植物分子生物學(xué)研究的重要基礎(chǔ)之一[1]。污染、褐化、玻璃化等是組織培養(yǎng)存在的主要問題，其中污染最普遍 [2]。因此采取有效的防控措施，降低污染發(fā)生的機率，是組織培養(yǎng)成功的重要保障。殼聚糖（chitosa

90、n）是甲殼素在強堿性條件下進行脫乙酰基作用后形成的一種重要的衍生物， 是由多個N-乙酰氨基葡萄糖通過β-(1-4)糖苷鍵連接起來，但它的性質(zhì)較為活潑。殼聚糖具有天然抑菌性能，且抑菌譜廣，近年來殼聚糖在各個領(lǐng)域如農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)[3]、制造[4]、食品[5]等方面中的運用受到很大的重視。有關(guān)殼聚糖在組織培養(yǎng)中的抑菌應(yīng)用尚未見報道。本實驗擬從污染的紅掌繼代培養(yǎng)基中提取、純化污染菌并進行鑒定， 用不同分子量及其不同濃度的殼聚糖對其進行抑制實驗， 摸

91、索出抑菌效果最好的殼聚糖分子量及最佳抑菌濃度，為探索殼聚糖成為新型的抑菌劑提供具體信息。 </p><p><b>　　1 材料與方法</b></p><p>　　1.1 試驗材料 </p><p>　　1.1.1 供試菌株 </p><p>　　霉菌污染菌（代號 WCHPA），分離于實驗室污染的紅掌繼代培養(yǎng)基中。

92、</p><p>　　1.1.2 供試藥品 </p><p>　　殼聚糖，有浙江澳興生物科技有限公司提供，分子量為3kd（脫乙酰度〉80%） ，50kd（脫乙酰度〉90%），25kd（脫乙酰度〉90%）[6]。 </p><p>　　1.1.3 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基 </p><p>　　土豆200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水10

93、00ml，pH值自然。 </p><p>　　1.2 試驗方法 </p><p>　　1.2.1 污染菌的分離及純化 </p><p>　　在超凈工作臺中挑出紅掌繼代培養(yǎng)基中的污染真菌，接到PDA培養(yǎng)基中。重復(fù)若干次，直至菌落特征及其顯微形態(tài)不再有變化，可確定菌種已純化。 </p><p>　　1.2.2 污染菌的鑒定 </p&

94、gt;<p>　　連續(xù)觀察純化后的菌落形態(tài)。制作裝片，進一步形觀察菌株、菌絲、孢子、產(chǎn)孢細胞的形態(tài)及產(chǎn)孢細胞的產(chǎn)孢方式和形態(tài)等，用數(shù)碼顯微鏡進行拍照。 </p><p>　　1.2.3 抑菌試驗 </p><p>　　稱取不同分子量殼聚糖用 1M 的乙酸溶液溶解后與PDA培養(yǎng)基混合，制成殼聚糖終濃度分別為（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0）mg/ml 的培養(yǎng)基

95、，用 1M 的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) pH 值為 6.0，對照除不加殼聚糖外，其他與加有殼聚糖的培養(yǎng)基相同[7]。高壓滅均鍋121℃下滅菌30min后倒平皿。產(chǎn)生白色菌絲24h后變?yōu)榫G色繼而變?yōu)楹稚z發(fā)達，絨狀，培養(yǎng)3d左右，在褐色菌絲中間有白色絮狀的菌毛產(chǎn)生。菌絲有隔，分生孢子梗長，產(chǎn)生側(cè)向分枝，分生枝上輪生短的產(chǎn)孢瓶體。分生孢子單胞卵圓形、光滑。 </p><p><b>　　2 結(jié)果與分析 <

96、;/b></p><p>　　2.1 紅掌繼代培養(yǎng)基污染癥狀 </p><p>　　在紅掌繼代培養(yǎng)基中長出褐色的菌毛，培養(yǎng)基表面呈黑色，褐色的菌絲上間有白色絮狀的菌絲。 </p><p>　　2.2 真菌純培養(yǎng)的形態(tài)特征及鑒定結(jié)果 </p><p>　　菌落在 PDA 培養(yǎng)基上等徑生長，邊緣整齊，孢子萌發(fā)加入殼聚糖的PDA培養(yǎng)基，4d后

97、能明顯觀察到菌落周圍有黑色暈圈，且黑色暈圈隨著菌落的生長而向外移。一般抑菌效果越好黑色暈圈越明顯[8]。對照菌落始終沒有出現(xiàn)這種現(xiàn)象。殼聚糖的分子量和濃度影響抑菌效果。 </p><p>　　2.3相同濃度的三種分子量殼聚糖抑菌效果的比較</p><p>　　濃度為0.5mg/ml 3種分子量殼聚糖對WCHPA菌落的抑制效果 6個濃度3種分子量殼聚糖對WCHPA菌落的抑菌率結(jié)果0.5mg/

98、ml 濃度的 3 種分子量殼聚糖之間沒有明顯的規(guī)律， 最高抑菌率出現(xiàn)在分子量為5萬的殼聚糖培養(yǎng)基中為20.45%。抑菌率和時間上也沒有緊密的聯(lián)系。結(jié)果表明在0.5mg/ml 濃度下3種分子量的殼聚糖的抑菌效果都不理想[9]。第5d之前3種分子量殼聚糖分子量越大抑菌率越高，而且都是隨著時間的延長抑菌率降低。在第5d，3000 分子量的抑菌率超過其它兩種分子量的抑菌率，而3000分子量的抑菌率也達到最高值。在第7d后抑菌效果和第5d之前的相

99、似，分子量越大抑菌率越高。</p><p><b>　　3 討論與結(jié)論 </b></p><p>　　3.1 殼聚糖成為新型抑菌劑的可能 </p><p>　　植物組培的污染大致可分為兩種，一種是操作中產(chǎn)生得污染，主要是霉菌的污染；一種是外植體自身所帶雜菌主要是由真菌和細菌的污染[10]。高抑菌率高達79.55%?？股厥乾F(xiàn)在組培中最常見，分

100、子量對殼聚糖抗菌性能有重要影響，從實驗結(jié)果來看5萬和 25 萬殼聚糖的抑菌效果要好于3000 分子量的；最高抑菌率出現(xiàn)在 25 萬分子量 3.0mg/ml和 2.0mg/ml 兩個濃度中。但總體考慮到價格及其操作因素上本實驗的結(jié)論是5萬分子量1.5mg/ml濃度為最佳。 </p><p>　　3.2 濃度對殼聚糖抗菌性能有重要影響 </p><p>　　鐘秋平[11]的研究結(jié)果均表明殼聚糖

101、的抑菌作用隨其濃度的增加而增大，本實驗結(jié)果支持上述研究結(jié)果。 甲殼素應(yīng)用范圍廣泛，殼聚糖在醫(yī)學(xué)、食品、環(huán)保、日化用品等領(lǐng)域都有著廣泛而重要的應(yīng)用。將殼聚糖用于花卉組織培養(yǎng)將有很好的前景。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1]M.K..Razdan.肖尊安,祝揚譯.植物組織培養(yǎng)導(dǎo)論[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2006:1-2. &l

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