廣東TTSuVs流行病學調查與TTSuV2 ORF1抗原性分析.pdf

1、輸血傳播病毒(Transfusiontransmittedvirus，TTV）是一種小的，無囊膜的，單股環(huán)狀負鏈的人畜共患DNA病毒，TTV的發(fā)現(xiàn)是于1997年底由NiShizawa運用代表性差異分析技術(Representationaldifferenceanalysis)從一名非甲一庚型肝炎病人的血清中克隆得到的病毒DNA片段，隨后，人們在非靈長類以及豬、牛、羊、犬，貓、家禽等多種家養(yǎng)及野生動物體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了TTV的感染。豬源TTV(

2、TTSuVs)在世界范圍內(nèi)廣泛檢出，引起人們的極大關注。目前TTSuVs的診斷主要依賴DNA的檢測，由于豬源TTV具有潛在的危害，因此對其抗原性進行分析是非常必要的。本實驗利用基因重組技術將TTSuV2ORF2基因克隆至原核表達系統(tǒng)中，制備獲得了具有生物學活性的重組Cap蛋白，并進行了免疫原性研究，主要研究內(nèi)容如下:
　　1、為了解廣東省豬群中豬輸血傳播病毒(TTSuVs)的感染情況，本研究采用Nest-PCR方法對廣東省7個不同

3、地區(qū)規(guī)?；i場抽檢采集的159份育肥豬血清進行檢測。結果表明，TTSuVs的兩個種TTSuV1和TTSuV2的陽性檢出率分別為54.72％和35.22％，二者的共感染率為29.56％，說明TTSuVs在廣東豬群中有較為廣泛的傳播。挑選Nest-PCR檢測TTSuV1和TTSuV2為陽性的樣品，分別在病毒保守區(qū)設計引物，擴增病毒基因，并對比分析通過PCR擴增獲得的TTSuVs結構蛋白編碼區(qū)ORF1與NCBI上其它已發(fā)表的不同屬種TTVsO

4、RF1序列的進化關系和同源性。結果表明豬TTV與人、犬、貓、猴的TTVs處在進化樹的不同分枝，具有很大差異;本次研究獲得的TTSuV1ORF1序列與國內(nèi)多株已發(fā)表的TTSuV1ORF1序列同源性為72％-75％;獲得的TTSuV2ORF1序列與現(xiàn)有測序的多株TTSuV2的ORF1序列同源性為88％-97％。
　　2、以本實驗室保存的TTSuV2-GDIMA1為模板設計引物，進行ORF1序列的PCR擴增、克隆及測序。通過對TTSuV

5、2ORF1蛋白的抗原性，信號肽，跨膜區(qū)，親疏水性和二級結構進行預測分析，將TTSuV2ORF1截短成VP1、VP2兩個片段，分別將這兩片段連入pET-21b載體并通過大腸桿菌系統(tǒng)進行表達。通過蛋白純化，切膠回收獲得高純度的目的蛋白。以獲得的高純度ORF1-VP1與ORF1-VP2蛋白為抗原，以血清樣品中經(jīng)Nest-PCR檢測TTSuV2呈陽性的樣品進行WesternBlot檢測。結果顯示ORF1-VP1與ORF1-VP2的表達產(chǎn)物均為包

6、涵體。WesternBlot結果證實，豬對TTSuV2的感染的確產(chǎn)生了抗TTSuV2ORF1的IgG抗體，且兩段蛋白均具有抗原性。本研究對TTSuV2ORF1蛋白的生物信息學特性進行了一定的探索，有利于監(jiān)測TTSuV2的進化情況，為深入研究該病毒的遺傳變異和蛋白質功能奠定一定的生物學基礎。
　　3、為了分析和篩選TTSuV2ORF1抗原性較好的區(qū)域，本試驗將通過大腸桿菌表達系統(tǒng)表達出的TTSuV2ORF1-VP1和VP2重組蛋白純

7、化后作為間接ELISA檢測方法的抗原，與Nest-PCR共同檢測213份豬血清中抗TTSuV2的IgG抗體和病毒DNA。結果顯示Nest-PCR檢測呈陰性的部分樣本，通過血清學檢測呈現(xiàn)出較高抗體水平;而Nest-PCR檢測呈陽性的部分血清樣品，其抗體水平卻相對較低。TTSuV2ORF1-VP1蛋白和VP2蛋白均具有良好反應原性，實驗結果預示其中可能存在中和位點。用商品化的ELISA試劑盒檢測相同血清中CSFV、PRRSV、PRV、HCV