副豬嗜血桿菌分子流行病學及其OMP-P2基因抗原性與檢測技術研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，H.parasuis）是豬Gl(a)ser's病的病原體，豬上呼吸道的一種共棲菌，它可在特定條件下侵入機體而引起以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關節(jié)炎和腦膜炎為特征的全身性疾病。目前，我國很多省市患病豬群中均可分離獲得副豬嗜血桿菌，該菌已成為保育豬死亡的主要原因之一，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經濟損失。但由于不同血清型及同一血清型的不同菌株之間抗原性差異較大，交叉保護性差;同時該菌的毒力因子

2、和保護性抗原尚不十分清楚，因此，目前尚無有效的預防和控制措施。
　　 本研究對副豬嗜血桿菌的部分生物學特性及分子流行病學進行了研究，建立了P2-PCR檢測方法，對副豬嗜血桿菌外膜蛋白P2（Out membarine protein P2，OMP P2）進行了克隆表達及ELISA抗原性試驗，并通過攻毒保護試驗證實了對高致病性毒株攻毒有較好的免疫保護效果。本研究內容分為以下5個部分:
　　 1.副豬嗜血桿菌的分離鑒定與部分生

3、物學特性比較
　　 將血清5型副豬嗜血桿菌參考株HS-DY05接種固體培養(yǎng)基TSA、PPLO瓊脂、巧克力瓊脂、胰(眎)蛋白胨瓊脂和液體培養(yǎng)基TSB、PPLO液體、胰(眎)蛋白胨和馬丁肉湯，通過觀察菌落大小、平板計數試驗，結果證明TSA和TSB是該菌的最適培養(yǎng)基。采集123份臨床疑似副豬嗜血桿菌病病例，通過病理剖解、TSA和TSB分離培養(yǎng)、和生化鑒定，分離獲得111株HPS分離株。HPS HB070214接種于TSB，37℃、18

4、0 r/min培養(yǎng)10～12h，菌數可達到109 cfu/mL。通過革蘭氏染色鏡檢和電鏡觀察，HPS分離株具有形態(tài)多樣性，并在莢膜和菌毛上有較大差異。對分離菌用22種常規(guī)的抗菌藥物進行了紙片法藥敏試驗，結果表明，高敏比例在50％以上的藥物依次有頭孢哌酮、頭孢西丁、頭孢他啶、復方新諾明、多粘菌素、替米考星、頭孢噻呋和頭孢曲松。乙酰甲喹、強力霉素、氟苯尼考、利福平、恩諾沙星和磺胺六甲氧嘧啶等常用藥物均已出現50.0％以上的耐藥菌株。將15種

5、血清型HPS接種仔豬，觀察其致病作用，結果為:HPS血清6、7、8和11型HPS毒力很弱或沒有致病性，血清4、5、12和13型HPS則具有很強毒力或致病性，血清1、2、9、10、11、14和15型HPS顯示出中等的致病力，與國外報道的HPS各血清型的毒力特點基本一致。將15種血清型HPS菌液滅活后，免疫家兔制備血清，結果為HPS瓊擴試驗抗體效價在1∶8以上，15種血清型菌株之間的相互交叉免疫保護反應，表明不同血清型HPS全菌高免血清存在

6、廣泛的交叉免疫反應，不同血清型HPs存在共同抗原。
　　 2.ERIC-PCR技術用于副豬嗜血桿菌分離株基因分析
　　 采用腸桿菌基因間重復一致序列PCR方法，在對15種副豬嗜血桿菌血清型參考株鑒定獲得15種不同ERIC-PCR指紋的基礎上，對分離自中國東南部發(fā)生Gl(a)sser's病的不同豬場的111株副豬嗜血桿菌進行了指紋鑒定。結果顯示:111株分離株顯示出23種指紋圖譜，前三種最流行的指紋圖譜為ERIC-PCR

7、XX(20/111)，XXIII(9/111)和IV(8/111)。且在111株分離株中，來自不同地區(qū)的分離株分別表現出不同種類的指紋圖譜。該試驗表明ERIC-PCR方法可適用于對某一地區(qū)的副豬嗜血桿菌進行分子流行病學的研究和基因型的鑒定;試驗結果還揭示了副豬嗜血桿菌在中國東南部地區(qū)已廣泛存在并具有多樣的基因型。15種血清型的HPS參考株和111株HPS分離株的ERIC-PCR指紋圖譜均顯示各菌株均有一大小在1100bp左右的基因。該結

8、果表明，中國東南部地區(qū)已廣泛存在并具有多樣的基因型，ERIC-PCR方法可用于副豬嗜血桿菌分子流行病學研究，同時，為今后尋找HPS的共同抗原基因提供了理論依據。
　　 3.副豬嗜血桿菌OMP P2基因序列測定與基因分型
　　 根據HB070412 ERIC-PCR指紋圖譜中特異基因的測序結果，利用已分離的菌株HB070412，根據NCBI上GENBANK中的HPS序列(ZP_02477753)設計了一對引物，用PCR方法

9、擴增了副豬嗜血桿菌外膜蛋白中的穿孔素前體蛋白P2基因(OMP P2)，并克隆到載體pMD18-T(T-Vector)，序列測定結果表明HB070412 OMPP2基因全長1077bp，序列同源性分析表明該基因相當保守，與所報道的HPS OMP P2基因之間的核苷酸序列同源性為98.1％，氨基酸序列同源性為95.5％。以此序列設計引物對15種血清型HPS參考株和分離株AH080412、AH080526、GX080413、JS070421、

10、QD080725、ZJ080625和HB070214進行了OMP P2基因的擴增產物測序和序列分析，結果表明所測菌株的OMP P2可分為2個基因型:GenotypeⅠ和GenotypeⅡ。GenotypeⅠ的OMP P2基因大小在1077bp到1095bp之間，GenotypeⅡ的基因大小在1167bp到1203bp之間，GenotypeⅠ和GenotypeⅡ在氨基酸水平具有92.8％的同源性，在核苷酸水平的同源性則為96.6％;在蛋白

11、水平GenotypeⅠ比GenotypeⅡ的OMP P2少27-42氨基酸，GenotypeⅠ的菌株均為致病性菌株，而GenotypeⅡ的菌株則不具致病性。
　　 4.副豬嗜血桿菌重組OMP P2蛋白的高效表達與抗原性研究
　　 用pGEX-6p-1構建了原核表達載體pGEX-P2，在大腸桿菌中進行了高效表達，表達蛋白約占菌體總蛋白的50％，主要為包涵體形式。SDS-PAGE電泳結果顯示表達的融合蛋白約為65kDa，We

12、stern-blot結果表明該表達蛋白具有抗原性。
　　 根據GenBank中副豬嗜血桿菌(HPS)的P2蛋白基因序列，設計合成1對特異性引物，用P2-PCR方法從HB070214株中克隆了大小為1077bp的P2蛋白基因。將P2蛋白基因亞克隆到原核表達載體pET-32a中構建了重組表達質粒pET-P2，在IPTG的誘導下成功表達了相對分子質量約為60500的可溶性融合蛋白P2-His;經SDS-PAGE和凝膠薄層掃描分析，融合

13、蛋白的表達量約占細菌總蛋白量的30％。將融合蛋白加入鎳瓊脂糖凝膠樹脂層析柱，經300mmol/L咪唑磷酸鹽緩沖液洗脫，其純度可達92.5％。用Western blotting分析純化后的融合蛋白，顯示良好的生物學活性。利用純化融合蛋白作包被抗原及優(yōu)化EL ISA反應條件，建立了可檢測抗HPS P2蛋白抗體的間接ELISA方法(P2-ELISA)，并將所建立的P2-ELISA與國外進口的HPS檢測試劑盒Synbiocits-ELISA對1

14、96份臨床送檢血清進行平行檢測，陽性符合率為93.4％。結果表明，本試驗建立的P2-ELISA與Synbiocits-ELISA具有同樣高的特異性。小鼠免疫試驗結果表明OMP P2蛋白對小鼠的攻毒保護率為80％。
　　 5.副豬嗜血桿菌OMP P2基因PCR檢測方法的建立與應用
　　 通過反應條件的優(yōu)化、特異性和敏感性的測定，建立了一種快速、簡便、準確的PCR方法，用于檢測副豬嗜血桿菌(HPS) OMP P2基因。PCR

15、擴增片段大小為1080 bp左右，最小檢測量為1000個HPS。與胸膜肺炎放線桿菌、多殺性巴氏桿菌、大腸桿菌、腸沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌無特異性反應。用該法檢測人工感染豬的肺臟、心臟和腎臟抽提的DNA，結果為陽性;檢測肝臟、脾臟、腦組織樣品抽提的DNA，結果為陰性。用該法檢測人工感染發(fā)病仔豬及自然感染仔豬肺組織，并結合細菌分離培養(yǎng)，證明以肺臟組織為病料，通過細菌分離培養(yǎng)，再用PCR法鑒定分離菌體，可有效地用于HPS的特異診斷。檢