副豬嗜血桿菌分子流行病學(xué)及hhdA基因克隆表達(dá)和免疫保護(hù)效力研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，HPS）是豬的革拉斯氏病的病原體，可引起以豬多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎等癥狀。近年來，隨著我國規(guī)?；B(yǎng)豬場的發(fā)展，該病已經(jīng)成為豬發(fā)病率和死亡率增加的重要原因之一。本研究對(duì)2012年-2014年期間江西地區(qū)HPS臨床分離株在已進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)方法血清型分型基礎(chǔ)上進(jìn)行ERIC-PCR基因型分析。通過對(duì)副豬嗜血桿菌hhdA基因克隆，并在進(jìn)行HPS hhdA蛋白生物學(xué)信息預(yù)測的基礎(chǔ)上，將HPS

2、hhdA蛋白進(jìn)行原核表達(dá)與鑒定，以及進(jìn)一步研究其免疫原性，具體如下：
　　1、2012年-2014年江西地區(qū)HPS分離株ERIC-PCR基因分型研究
　　以15株副豬嗜血桿菌不同血清型的標(biāo)準(zhǔn)菌株為參照，對(duì)2012～2014年江西地區(qū)的41株HPS分離株進(jìn)行基因分型，總共56株菌（41株HPS江西分離株和15株參考菌株）被分為44個(gè)基因型，之前無法通過血清分型的8株菌株均得到ERIC-PCR基因分型充分分型，從而彌補(bǔ)了傳統(tǒng)血清

3、分型方法不能完全分型的缺陷。
　　2、副豬嗜血桿菌hhdA基因的克隆與生物信息學(xué)分析
　　本研究應(yīng)用PCR技術(shù)成功的擴(kuò)增了副豬嗜血桿菌的hhdA基因序列，獲得了長1797bp的hhdA基因，編碼599個(gè)氨基酸，推導(dǎo)出蛋白質(zhì)的分子量大小為61.1kDa的親水性蛋白；該蛋白由內(nèi)向外和由外向內(nèi)各有可能一個(gè)跨膜區(qū)域；通過蛋白質(zhì)的信號(hào)肽預(yù)測hhdA蛋白無信號(hào)肽，為細(xì)胞內(nèi)蛋白；對(duì)hhdA蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測和分析，結(jié)果顯示hhdA含

4、有較多α-螺旋、β-折疊、β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲等二級(jí)結(jié)構(gòu)，而且有較多柔性區(qū)域，呈散在分布。與GenBank上公布的ZJ0906株(CP005384)中對(duì)應(yīng)的核苷酸序列同源性為99.9％，氨基酸同源性99.8％，測定表明HPS的hhdA基因十分保守。
　　3、HPS hhdA基因的原核表達(dá)及其免疫保護(hù)作用的研究
　　將擴(kuò)增的hhdA基因克隆于原核表達(dá)載體pET-32a(+)中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-hhdA，后轉(zhuǎn)化

5、至受體菌E.coli BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，通過SDS-PAGE和Western blot分析重組hhdA蛋白的表達(dá)情況和反應(yīng)原性。重組蛋白經(jīng)鎳柱親和層析純化后免疫小鼠，檢測其特異性血清IgG抗體水平及攻毒保護(hù)率。結(jié)果表明，SDS-PAGE得到約82KDa與預(yù)期分子質(zhì)量大小一致蛋白；Western blot分析顯示，該重組蛋白具有良好反應(yīng)原性。動(dòng)物免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明，重組hhdA蛋白免疫后能誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的hhdA特異