副豬嗜血桿菌OMP P2基因PCR檢測(cè)方法的建立與四川地區(qū)HPs分子流行病學(xué)調(diào)查.pdf

1、副豬嗜血桿菌病是由副豬嗜血桿菌(Haemophilus Parasuis，HPs)引起豬的一種常見(jiàn)的細(xì)菌性疾病，該病在我國(guó)的流行越來(lái)越廣泛，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失，快速準(zhǔn)確診斷和掌握流行病學(xué)規(guī)律對(duì)指導(dǎo)該病的防控非常重要。針對(duì)現(xiàn)有方法的不足，本研究建立了一種檢測(cè)HPs的PCR方法，并運(yùn)用該方法對(duì)四川地區(qū)HPs進(jìn)行了分子流行病學(xué)調(diào)查，掌握了近期四川地區(qū)HPs的流行與分布、部分基因的分子進(jìn)化特征，為四川地區(qū)開(kāi)展該病的防控監(jiān)測(cè)、流行風(fēng)

2、險(xiǎn)分析、HPs基因數(shù)據(jù)庫(kù)的建立及疫苗研制等奠定了基礎(chǔ)。
　　1.副豬嗜血桿菌OMP P2基因PCR檢測(cè)方法的建立
　　本研究參照Genbank公布的HPs外膜蛋白P2基因，選擇其保守區(qū)域設(shè)計(jì)針對(duì)所有血清型HPs的PCR通用檢測(cè)引物，通過(guò)對(duì)退火溫度、引物濃度等條件的摸索優(yōu)化，成功建立了PCR快速檢測(cè)方法，將標(biāo)準(zhǔn)菌株HS80 PCR產(chǎn)物序列進(jìn)行測(cè)定和比對(duì)，結(jié)果表明序列同源性達(dá)97％～99％，證明了該P(yáng)CR方法對(duì)靶序列克隆的準(zhǔn)確性

3、。再以15個(gè)血清型的HPs標(biāo)準(zhǔn)菌株和鏈球菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、丹毒桿菌等7種參考菌株對(duì)該方法的特異性和重復(fù)性進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示該方法特異性強(qiáng)重復(fù)性好，且可檢測(cè)到15個(gè)血清型的HPs菌株。靈敏性結(jié)果表明最低檢測(cè)量為173 CFU，靈敏性較高。同時(shí)，研究結(jié)果還表明該方法可快速準(zhǔn)確檢測(cè)臨床疑似HPs病料。綜上所述，本研究建立的PCR方法特異性強(qiáng)、靈敏性高、重復(fù)性好，可用于對(duì)臨床疑似分離菌株的鑒定，也可用于HPs的分子流行病學(xué)調(diào)查。

4、　　2.四川地區(qū)HPs的分子流行病學(xué)調(diào)查
　　本研究于2013年6月至2013年12月期間在四川省成都、綿陽(yáng)、樂(lè)山、眉山、雅安、廣安、南充、德陽(yáng)等17個(gè)市縣20多個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)收集疑似HPs病料131份，運(yùn)用所建立的PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，累計(jì)檢出陽(yáng)性病料26份，檢出率19.8％，陽(yáng)性樣品均檢出于斷奶前后和保育階段病豬，來(lái)源地覆蓋了11個(gè)地區(qū)，表明HPs已在四川多個(gè)地區(qū)廣泛流行，主要危害斷奶前和保育階段的豬群，所以對(duì)該病的防控應(yīng)給予高度

5、的重視。通過(guò)對(duì)從陽(yáng)性病料中分離的12株HPs和本室2009年分離的HPs的SC01株進(jìn)行espp2基因克隆測(cè)序，并進(jìn)行這13條序列核苷酸同源性、推導(dǎo)氨基酸同源性及其差異位點(diǎn)和遺傳進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建等分子特征分析，結(jié)果表明13株四川HPs分離株被分為兩個(gè)基因類群，且在核苷酸和氨基酸序列上具有高度的同源性。由此表明四川地區(qū)流行的HPs菌株基因型總體差異不大，同源性較高。綜上所述，HPs已在四川地區(qū)廣泛分布與流行，主要危害斷奶前和保育階段的豬群，四川