斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征中多病原體混合感染的分子流行病學(xué)調(diào)查.pdf

1、斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)于1991年在加拿大被首次發(fā)現(xiàn)，并由Harding和Clark于1996年首次報(bào)道該病，隨后美洲、歐洲和亞洲各國(guó)相繼報(bào)道了該病。起初認(rèn)為該病是由豬圓環(huán)病毒(PCV2)引起的一種以漸進(jìn)性消瘦、淋巴結(jié)腫大、呼吸困難、偶爾出現(xiàn)腹瀉、皮膚蒼白及黃疸為特征的高度接觸性傳染病，主要侵害7～15周齡的斷奶豬和生長(zhǎng)豬，豬群患病率為3～30％，致死率高達(dá)80～100％。近年來(lái)，該病的發(fā)生呈上升趨勢(shì)，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的

2、經(jīng)濟(jì)損失.現(xiàn)已證實(shí)多病原體混合感染是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要致病因素，其中PCV2是PMWS的重要病原?；旌细腥局谐Ｒ?jiàn)的病原體有:豬繁殖和呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬輸血傳播病毒(PTTV）;最近各國(guó)學(xué)者在PMWS樣品中還發(fā)現(xiàn)PCV2與新型細(xì)小病毒混合感染的現(xiàn)象，如:豬細(xì)小病毒4型(PPV4)、博卡病毒(PBoV)及豬Hokovirus(PHoV)等。
　　 本研究主要從流行病學(xué)角度，檢測(cè)臨床樣品中各種病原

3、體的感染率和混合感染的流行情況，并通過(guò)測(cè)序?qū)χ饕牟≡M(jìn)行遺傳變異分析，闡明混合感染中主要病原的分子流行病學(xué)和遺傳變異規(guī)律。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容主要包括以下幾個(gè)方面:
　　 1.PMWS多病原體的流行病學(xué)調(diào)查
　　 參照國(guó)內(nèi)外已發(fā)表文獻(xiàn)中引物，或根據(jù)GenBank上已發(fā)表病原體基因序列設(shè)計(jì)引物建立針對(duì)各病原體的PCR檢測(cè)方法，對(duì)2009～2012年在江蘇、浙江等省采集的1183份樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示PCV2的陽(yáng)性率為47.00％(

4、556/1183)，PBoV1的陽(yáng)性率為22.49％(266/1183)，PBoV3-4的陽(yáng)性率為15.56％(75/482)，PHoV的陽(yáng)性率為19.86％(235/1183)，TTV1的陽(yáng)性率為17.58％(208/1183)，TTV2的陽(yáng)性率為19.86％(235/1183)，PPV4的陽(yáng)性率為17.89％(102/570)，PRRSV的陽(yáng)性率為28.32％(145/512)。不同角度統(tǒng)計(jì)的檢測(cè)結(jié)果顯示，發(fā)病樣品中PCV2及PPV

5、4的陽(yáng)性率顯著高于健康樣本中的陽(yáng)性率;發(fā)病樣本中PCV2與其他病原體混合感染率與健康樣本中的混合感染率差異顯著;PCV2在30～60日齡樣本中的檢出率最高;發(fā)病樣本不同組織臟器中，PCV2的陽(yáng)性感染率都很高，差異不明顯。
　　 2.PCV2流行株ORF2部分基因序列測(cè)定及遺傳分析
　　 為了研究江蘇省豬群PMWS主要病原PCV2流行毒株的遺傳變異情況，以2009～2012年臨床組織樣品DNA為模板，對(duì)PCV2流行株ORF

6、2的部分基因進(jìn)行擴(kuò)增、克隆和序列測(cè)定。并利用DNAman和DNAstar軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)26株P(guān)CV2 ORF2部分基因序列同源性在87.1％～100％之間，與國(guó)內(nèi)外經(jīng)典毒株的同源性在83.3％～97.1％之間。同時(shí)利用PCV2全長(zhǎng)基因組引物在糞便中擴(kuò)增出1株P(guān)CV2完整序列(JSTZ-4)，GenBank登錄號(hào)為JQ413808。在國(guó)內(nèi)首次對(duì)糞便中的PCV2進(jìn)行序列分析，結(jié)果顯示該毒株與國(guó)內(nèi)PCV2基因序列的同源性為9

7、5.0％～99.9％，與國(guó)外糞便中分離到PCV2基因序列的同源性為94.9％～97.9％。
　　 3.PBoV3-4型流行株部分基因序列測(cè)定及遺傳分析
　　 豬博卡病毒是最新發(fā)現(xiàn)的一種DNA病毒，于2009年首次在瑞典患斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的豬體內(nèi)被鑒定。為及時(shí)了解PBoV在我國(guó)的流行及遺傳變異情況，本研究利用PCR方法擴(kuò)增PBoV3-4亞型流行株的NS1部分基因序列，T克隆后進(jìn)行測(cè)序，利用DNAstar軟件對(duì)測(cè)序結(jié)

8、果進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與PBoV3(JG512472)的同源性在89.3％～95.8％之間;與PBoV4(JF512473)的同源性在86.8％～91.1％之間。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，9株與PBoV3(JG512472)在同一分支上，另外9株與PBoV4(JF512473)在同一分支上.
　　 4.PRRSV ORF5基因序列測(cè)定及遺傳分析
　　 PRRSV作為一種RNA病毒，其基因組容易發(fā)生變異，因此掌握PRRSV的流行變異趨

9、勢(shì)對(duì)該病的防治是非常有意義的。本研究選用PRRSV ORF5作為靶基因，分析2011～2012年江蘇省PRRSV流行株的遺傳變異情況。結(jié)果顯示這11株P(guān)RRSV ORF5基因序列與5株國(guó)內(nèi)外代表毒株的同源性為86.5％～98.7％。與強(qiáng)致病性毒株JXA1的同源性最高，與美洲型毒株VR-2332的同源性最低。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析也顯示11株P(guān)RRSV與高致病性毒株在同一分支上。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)PCR檢測(cè)臨床樣品中各病原體的單一感染率及