番茄,辣椒和胡蘿卜的精細胞以及卵細胞的分離.pdf

1、高等植物的卵細胞深藏在子房內(nèi)的胚珠體細胞組織中,而精細胞位于花粉營養(yǎng)細胞中。受精過程和胚胎發(fā)生過程則在珠心內(nèi)的胚囊中完成,這對高等植物受精機理研究形成了很大的障礙。而將高等植物的精、卵細胞和其他雌配子體細胞分離出來,在體外誘導(dǎo)精、卵細胞的融合以及對人工合子和其他分離得到的雌配子細胞體外進行細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的研究可克服這種障礙。
　　 本實驗中,我們嘗試分離番茄、辣椒和胡蘿卜具有生活力的精、卵細胞,為進一步的研究番茄、辣椒和

2、胡蘿卜雌雄配子體的分子生物學(xué)特性及受精機理等提供了條件。
　　 1.番茄精、卵細胞的分離:番茄的花粉屬于二胞型。本實驗采用直接爆破花粉粒的方法分離具生活力的生殖細胞,并收集成群體。嘗試離體萌發(fā)花粉管及活體一離體培養(yǎng)花粉管,成功分離到具生活力的精細胞。以開花當天的胚珠為材料,用酶解—解剖法分離得到一定數(shù)量的卵細胞、助細胞及中央細胞。在最佳條件下,30分鐘可從70個胚珠中分離出7個卵細胞。通過微吸管進行收集,在短時間內(nèi)可得到一定數(shù)量

3、的卵細胞及助細胞群體。對分離胚囊細胞的最佳滲透壓條件和酶液成分、含量進行了篩選。
　　 2.辣椒精、卵細胞的分離:辣椒的花粉屬于二胞型。本實驗采用直接爆破花粉粒的方法分離具生活力的生殖細胞,并收集成群體。并采用活體一離體法培養(yǎng)花粉管,成功分離到具生活力的精細胞。辣椒的子房內(nèi)有多個胚珠,取開花當天的胚珠,嘗試用酶解一解剖法分離胚囊細胞。在最佳條件下,30分鐘可從54個胚珠中分離到6個卵細胞。分離的辣椒卵細胞經(jīng)FDA染色后,熒光顯微

4、鏡下觀察其呈明亮的綠色熒光,表明其具有較強的生活力,而部分卵器中兩個助細胞其熒光的強弱存在明顯的差異。用顯微操作儀可收集到一定數(shù)量的卵細胞,以作為進一步研究辣椒卵細胞的分子生物學(xué)特性的實驗材料。
　　 3.胡蘿卜精、卵細胞的分離:胡蘿卜花粉屬于三胞型。在多種爆破液中,花粉粒都沒有反應(yīng)。用兩個解剖針擠壓胡蘿卜花粉粒使其破裂釋放出精細胞,達到分離、收集胡蘿卜精細胞的目的。用酶解一解剖方法分離胡蘿卜胚囊中的卵細胞、助細胞和中央細胞。胡

5、蘿卜胚珠先在酶液中酶解40-50 min,然后將其轉(zhuǎn)移到不含酶的分離液中用解剖針解剖胚珠。將胚珠的合點端切破,輕輕擠壓胚珠的珠孔,卵細胞、助細胞和中央細胞即可逸出。在最佳條件下,20分鐘可從20個胚珠中分離出5個卵細胞。對分離胚囊細胞的滲透壓和酶液成分進行了篩選。分離出的胡蘿卜精、卵細胞用顯微操作儀收集到一定數(shù)量,以作為進一步研究胡蘿卜卵細胞的分子生物學(xué)特性的實驗材料備進一步用。
　　 目前被子植物離體受精技術(shù)只在玉米和水稻兩種