外源水楊酸誘導(dǎo)RNAi與MAPK3級聯(lián)信號抗番茄黃化曲葉病毒研究.pdf

1、番茄黃化曲葉病毒病（Tomato yellow leaf curl disease，TYLCD）由番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）引起，嚴重威脅番茄安全生產(chǎn)。目前番茄抗TYLCV研究主要通過將野生材料中抗性基因、標記滲透到栽培品種中，或者通過RNAi（RNA interference）技術(shù)干擾病毒基因序列以達到抑制病毒基因組復(fù)制的目的。前者耗時長，抗性不穩(wěn)定，后者涉及到轉(zhuǎn)基因技術(shù)

2、，目前轉(zhuǎn)基因技術(shù)還沒有被消費者廣泛接受。誘導(dǎo)植物抗性為我們提供了一條新思路。誘導(dǎo)抗性是指植物在一些非生物或生物激發(fā)子刺激下，對隨后病原的侵染產(chǎn)生更快更強的防御反應(yīng)。植物誘導(dǎo)抗性主要包括兩種:一種是誘導(dǎo)系統(tǒng)獲得性抗性(ISR)，另外一種是系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)。ISR抗性途徑依賴于茉莉酸(JA)和乙烯(ET)信號。SAR可以通過前期病原侵染，也可以通過化學(xué)物質(zhì)，如水楊酸(SA)或水楊酸衍生物苯丙噻二唑(BTH)誘導(dǎo)植物SAR的發(fā)生。因此

3、，我們提出通過SA提高番茄對TYLCV誘導(dǎo)抗性的思路。誘導(dǎo)抗性需要MAPK級聯(lián)信號系統(tǒng)參與，而植物抗病毒需要RNAi信號參與;MAPK級聯(lián)信號、RNAi在SA介導(dǎo)抗性中到底發(fā)揮什么作用。
　　本試驗通過外源葉面噴施SA，檢測番茄植株TYLCV抗性指標，確定SA誘導(dǎo)番茄植株的最適濃度;然后通過最適SA濃度研究RNAi通路關(guān)鍵基因SlDCL2和SlDCL4以及誘導(dǎo)抗性關(guān)鍵基因MAPK3在番茄抗TYLCV防御中的作用，進一步研究它們與S

4、A信號的關(guān)系，對SA誘導(dǎo)抗性在抗TYLCV的作用機理做了一定研究，為植物誘導(dǎo)抗性抗病毒提供理論依據(jù)。主要結(jié)果如下:
　　(1)外源葉面噴施SA提高番茄植株對TYLCV耐性的最適濃度為0.5mM。用不同濃度的SA前處理感病材料‘TTI112B-2’，2天后人工接種TYLCV侵染性克隆，一個月后統(tǒng)計發(fā)病率(％)和發(fā)病指數(shù)。結(jié)果顯示0.5mM SA前處理植株的發(fā)病率(51.1％)和發(fā)病指數(shù)(29.3)顯著低于對照(68.8％，35.7)

5、，進一步研究發(fā)現(xiàn)RNAi通路相關(guān)基因被誘導(dǎo)表達，TYLCV對植物細胞膜的破壞降低，植物抗氧化能力提高、光合能力增強，植物葉片中病毒的相對含量降低，植株病癥減緩，經(jīng)檢測系統(tǒng)性抗性被誘導(dǎo)。
　　(2)DCL2和DCL4在番茄抗TYLCV防御方面至關(guān)重要。利用qRT-PCR技術(shù)檢測25個RNAi通路基因在抗感材料‘Y19’和‘TTI112B-2’中的差異，結(jié)果顯示:在抗感病材料中，大多數(shù)RNAi相關(guān)基因都可以被TYLCV誘導(dǎo)上調(diào)表達，但

6、是抗性材料中表達相對較高。通過VIGS技術(shù)沉默SlDCL2和SlDCL4，發(fā)現(xiàn)抗性材料TYLCV含量增加，病情指數(shù)增加，抗性被破壞，而感病材料提前發(fā)病，TYLCV含量同樣增加。
　　(3)SA誘導(dǎo)植物對TYLCV抗性需要DCL2和DCL4參與。用0.1mMSA前處理擬南芥dcl2，dcl4和dcl2/4突變體，24h后人工接種TYLCV，14天后qPCR、ELISA和半定量檢測TYLCV含量。結(jié)果顯示SA前處理可以抑制野生型擬南芥

7、Col-中TYLCV的復(fù)制，但是不能夠降低dcl2、dcl4和dcl2/4突變中的病毒含量。
　　(4)MAPK3參與調(diào)控番茄植株對TYLCV的耐性。TYLCV接種抗性番茄材料‘Y19’，qPCR、ELISA以及Western blot檢測結(jié)果顯示SlMAPK3參與番茄植株的抗TYLCV響應(yīng)。通過VIGS和植物過表達技術(shù)證明MAPK3參與調(diào)控SA、JA防御信號通路基因的SlPR1/SlPR2，SlLapA SlPI-Ⅰ/SlPI-

8、Ⅱ表達，提高了番茄植株的抗氧化能力，最終提高了植株對TYLCV的耐性。
　　(5)SA信號參與TYLCV病原誘導(dǎo)的MAPK3響應(yīng)。用0.1mM SA前處理SA信號中斷突變體npr1，24h后，人工接種接種TYLCV，12h后，Western blot檢測MAPK3活性，結(jié)果顯示野生型Col-中TYLCV誘導(dǎo)的MAPK3磷酸化增幅大于npr1中的。0.1mMSA前處理不能抑制mapk3中TYLCV的復(fù)制，但是可以降低野生型Col-中