百日草細(xì)胞核雄性不育兩用系差異表達(dá)基因的研究.pdf

1、百日草(Zinnia elegans Jacq.)是菊科百日草屬一年生草本花卉，在我國廣泛栽培，主要用作花壇、花叢及花境。百日草在繁育過程中，由于其隱性細(xì)胞核雄性不育具有敗育徹底、不育性穩(wěn)定和無不良胞質(zhì)效應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，在生產(chǎn)F1種子中廣泛應(yīng)用。然而，到目前為止，對(duì)這一材料的育性控制機(jī)制了解甚少。為了更好地利用隱性核不育材料，很有必要對(duì)其進(jìn)行深入的研究。
　　 本研究以百日草雄性不育兩用系MS5001AB為實(shí)驗(yàn)材料，運(yùn)用抑制消減雜交技

2、術(shù)(suppression subtractive hybridization，SSH)構(gòu)建了兩個(gè)cDNA文庫以分離可育株和不育株間差異表達(dá)基因，同時(shí)對(duì)得到的差異表達(dá)片段利用BLAST工具進(jìn)行序列同源性分析，并參照MIPS站點(diǎn)的擬南芥數(shù)據(jù)庫對(duì)有同源序列的片段進(jìn)行分類。根據(jù)部分差異表達(dá)基因的半定量RT-PCR表達(dá)結(jié)果，從中選出兩個(gè)與花發(fā)育相關(guān)EST，利用RACE技術(shù)獲得了兩個(gè)基因的cDNA和基因組全長(zhǎng)，并且對(duì)其序列進(jìn)行了分析。最后構(gòu)建其中

3、一基因的正、反義表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化煙草，對(duì)其進(jìn)行初步的功能驗(yàn)證。本研究獲得的結(jié)果和主要結(jié)論如下：
　　 (1)百日草筒狀花抑制消減cDNA文庫的構(gòu)建。以百日草雄性可育和不育敗育關(guān)鍵時(shí)期的筒狀花為研究材料，采用SSH技術(shù)成功構(gòu)建了兩個(gè)抑制消減cDNA文庫，共得到1536個(gè)克??；持家基因β-tubulin為指標(biāo)檢測(cè)文庫的消減效率，兩個(gè)文庫的消減效率均為25倍。利用斑點(diǎn)雜交技術(shù)對(duì)文庫中的所有1536個(gè)克降進(jìn)行篩選，得到525個(gè)陽性克隆。

4、序列分析顯示，可育庫和不育庫cDNA平均長(zhǎng)度分別為407 bp和386 bp；兩個(gè)文庫中共分離到167個(gè)非重復(fù)的表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tags，ESTs)，其中70個(gè)基因在雄性可育株中呈上升表達(dá)，97個(gè)基因在雄性不育中呈上升表達(dá)。利用BLAST工具對(duì)其進(jìn)行序列同源性分析，可育庫中發(fā)現(xiàn)一些與絨氈層和小孢子發(fā)育相關(guān)的基因，不育文庫中發(fā)現(xiàn)一些與花發(fā)育和細(xì)胞程序性死亡相關(guān)的基因。半定量RT-PCR結(jié)果顯示，6個(gè)基因

5、可能參與雄性育性形成，可育庫中的兩個(gè)基因僅在可育株花蕾中表達(dá)。參照MIPS站點(diǎn)的擬南芥數(shù)據(jù)庫，可育庫中有同源序列的59個(gè)EST可分成10個(gè)類別，最大三類依次為碳水化合物代謝(36%)、未分類蛋白(17%)和次級(jí)代謝類(14%)；不育庫中有同源序列的81個(gè)EST分為14個(gè)類別，最大三類依次為未分類蛋白(27%)、碳水化合物代謝(18%)和細(xì)胞組分的合成類(16%)。這些差異表達(dá)基因的獲得將為以后克隆花藥發(fā)育相關(guān)基因以及了解百日草核雄性不育

6、分子機(jī)理提供重要線索。
　　 (2)兩個(gè)百日草花發(fā)育差異表達(dá)基因的克隆與序列分析。以可育庫中的兩個(gè)EST為線索，利用RACE技術(shù)，從百日草中克隆出ZeMYB35和ZeSTR兩個(gè)基因的完整序列，并利用生物學(xué)軟件對(duì)序列進(jìn)行分析。Ze MYB35基因的cDNA序列全長(zhǎng)為1143 bp，ORF Finder預(yù)測(cè)其最大開放閱讀框?yàn)?85 bp，編碼294個(gè)氨基酸；Conservedomain程序搜索到ZeMYB35蛋白含有兩個(gè)典型的Myb

7、-like DNA-binding domain，一個(gè)位于第17-62氨基酸之間，另一個(gè)位于第70-113個(gè)氨基酸之間。核苷酸和氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，Ze MYB35與多種植物的MYB基因同源，其中與擬南芥MYB35的同源性為76%，表明它是MYB基因家族的一個(gè)新成員，屬于R2R3-MYB型。通過PCR方法獲得該基因的基因組序列，長(zhǎng)度為1264 bp；利用DNAMAN軟件將基因的gDNA序列與cDNA序列相比，顯示該基因包括兩個(gè)內(nèi)含子和三

8、個(gè)外顯子。
　　 ZeSTR基因的cDNA全長(zhǎng)為1402 bp，ORF Finder預(yù)測(cè)Ze STR基因的最大開放讀碼框全長(zhǎng)為1224 bp，編碼407個(gè)氨基酸；NCBI的Conserve domain程序預(yù)測(cè)該蛋白含有一個(gè)STR-Synth結(jié)構(gòu)域，位于第197-284個(gè)氨基酸之間，該結(jié)構(gòu)域是異胡豆苷合成酶的一個(gè)典型結(jié)構(gòu)特征。NCBI Blastp比對(duì)結(jié)果表明，ZeSTR蛋白與多種植物STR蛋白同源，其中與擬南芥STR蛋白(AA

9、042227.1)同源性最高，推測(cè)ZeSTR基因在百日草中編碼異胡豆苷合成酶。通過PCR方法獲得了該基因的基因組序列，長(zhǎng)度為2214bp；DNAMAN軟件比對(duì)基因的cDNA和gDNA序列，顯示該基因包括四個(gè)外顯子和三個(gè)內(nèi)含子。另外，cDNA和gDNA序列編碼區(qū)有四處堿基替換，可能由RNA編輯造成。研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究該基因的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)。
　　 (3)百日草ZeMYB35基因轉(zhuǎn)化煙草的研究。通過酶切、連接等步驟，構(gòu)建了Z