刺梨高含量抗壞血酸積累的分子機(jī)理研究.pdf

1、抗壞血酸(AsA)又名維生素C，是維持人類正常生長發(fā)育所必需的化合物，但人類自身不能合成AsA，因而不得不從能合成AsA的動植物中獲取，富含AsA的蔬菜和水果是人類攝取AsA的主要來源。刺梨(Rosa roxburghii Tratt)是薔薇科薔薇亞科薔薇屬植物，是一種原產(chǎn)于我國西南的新興果樹，刺梨果實(shí)含有多種對人類有益的化學(xué)物質(zhì)，尤其是富含AsA，鮮果AsA含量達(dá)到2200 mg/100gFW，因而備受關(guān)注，成為新興的“Vc之王”。然

2、而，對于刺梨果實(shí)積累如此高含量的AsA的分子機(jī)制尚不清楚。本文以三個基因型的刺梨為實(shí)驗(yàn)材料，從形態(tài)、細(xì)胞、生理、生化、分子等層面系統(tǒng)地研究了刺梨果實(shí)發(fā)育過程中，與果實(shí)AsA積累有關(guān)的AsA的合成、氧化分解、還原再生、運(yùn)輸和調(diào)控的變化和差異，并對可能導(dǎo)致刺梨積累高含量AsA的關(guān)鍵基因進(jìn)行了驗(yàn)證，獲得如下主要結(jié)果:
　　 1.刺梨果實(shí)發(fā)育過程中三個基因型的刺梨果實(shí)AsA含量變化趨勢基本相同，只是最終AsA含量有一定的差異，其中MpF

3、1達(dá)到1542 mg/100g FW。刺梨果實(shí)在花后40天內(nèi)幾乎沒有明顯AsA積累，99％的AsA是在之后的發(fā)育過程中快速積累的，其中花后65天至80天是積累速率最高的時期，15天積累的AsA接近總含量的一半。而葉片AsA的含量在果實(shí)發(fā)育過程中始終沒有明顯變化，平均含量只有成熟果實(shí)的1/100到1/30。
　　 2.刺梨果實(shí)發(fā)育過程中果實(shí)AsA的細(xì)胞學(xué)分布變化反映了AsA含量的變化。細(xì)胞內(nèi)，AsA主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，而在液泡中分

4、布極少;細(xì)胞間，AsA主要分布在果實(shí)的肉質(zhì)中果皮內(nèi)，尤其在靠近輸導(dǎo)組織的細(xì)胞中分布較多，而在外果皮分布極少。在果實(shí)發(fā)育初期，含量極少，分布也不明顯，而在果實(shí)發(fā)育后期，含量急劇上升，分布區(qū)域化也很明顯。
　　 3.刺梨果實(shí)發(fā)育過程中AsA合成和分解相關(guān)代謝物的含量變化也一定程度上支持了AsA含量的變化模式。L-半乳糖途徑合成AsA的前體或中間產(chǎn)物的含量的變化與AsA的積累速率的變化趨勢較一致，而AsA的各種分解產(chǎn)物的含量在整個果實(shí)

5、發(fā)育過程中一直處于較低水平;另外主要有機(jī)酸的含量的變化，與AsA的含量變化趨勢相似性很高。
　　 4.克隆了參與刺梨AsA合成代謝的全部重要基因共14個，分析了三個基因型材料中這些基因在果實(shí)發(fā)育過程中表達(dá)變化，其中循環(huán)途徑的脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）基因的表達(dá)變化與AsA的積累變化相似性最高。在所有合成路徑中，L-半乳糖途徑的GDP甘露糖表異構(gòu)酶(GME)基因的表達(dá)變化最能反映AsA積累速率的變化;另外，D-半乳糖醛酸途徑的

6、關(guān)鍵基因半乳糖醛酸還原酶(GalUR)基因在果實(shí)發(fā)育中期有顯著高表達(dá)，而肌醇途徑基因在果實(shí)發(fā)育中后期基本不表達(dá)。
　　 5.分析了果實(shí)發(fā)育過程中部分參與AsA合成代謝的酶活性在刺梨的變化，其中合成途徑的酶活性沒有顯著變化，而DHAR酶活性的變化與AsA含量的變化保持了較高同步性。還測定了果實(shí)發(fā)育過程中AsA和脫氫抗壞血酸(DHA)含量的變化，發(fā)現(xiàn)AsA氧化還原狀態(tài)的變化與DHAR的基因表達(dá)和酶活性的變化表現(xiàn)出很高一致性。

7、　　 6.分析了刺梨不同組織器官AsA和DHA的含量在果實(shí)發(fā)育過程中的變化，除了果實(shí)外，其他組織器官的DHA含量均顯著高于AsA含量，且DHA含量在果實(shí)成熟時從小葉、萼片、葉柄到果肉、種子、枝條依次降低。DHA的細(xì)胞學(xué)定位顯示DHA主要分布在光合組織和輸導(dǎo)組織中，且與果實(shí)中AsA的分布有緊密的聯(lián)系。
　　 7.克隆了刺梨DHAR和GME的全長cDNA，命名為RrDHAR和RrGME，比對和聚類分析表明它們都是作用于細(xì)胞質(zhì)的基因

8、。還克隆了普通草莓(Fragariaxananassa)的DHAR全長cDNA，與RrDHAR的同源性高達(dá)93％，兩者推導(dǎo)的蛋白在個別氨基酸位點(diǎn)有差異。此外還克隆了刺梨的AO和APX的全長cDNA，分析顯示AO作用于質(zhì)外體，而APX作用于細(xì)胞質(zhì)。
　　 8.構(gòu)建了RrDHAR和RrGME的超量表達(dá)載體并穩(wěn)定轉(zhuǎn)化了擬南芥，超量表達(dá)RrGME將擬南芥葉片的T-AsA含量提高了80％，將AsA提高了7.2倍，將AsA氧化還原水平的提高

9、3.3倍;而超量表達(dá)RrDHAR將T-AsA含量提高了40％，將AsA提高了9.7倍，且將AsA氧化還原水平的提升是超量表達(dá)RrGME的兩倍。檢測轉(zhuǎn)基因株系的莢果也得到了與葉片相近的結(jié)果。
　　 9.克隆了RrDHAR和RrGME的基因全長和部分啟動子序列，啟動子分析發(fā)現(xiàn)它們的啟動子除了都包含了基本的啟動子元件外，還都含有大量的光調(diào)控相關(guān)的順式元件，且明顯多于野草莓（Fragaria vesca）中同源基因的啟動子。
　　

10、 綜上所述，刺梨果實(shí)的AsA主要在中果皮的細(xì)胞質(zhì)中積累，在果實(shí)發(fā)育過程中，果實(shí)高含量AsA的積累是合成途徑與循環(huán)途徑共同作用的結(jié)果。L-半乳糖途徑是刺梨AsA合成的主要途徑，其中RrGME可能是控制半乳糖AsA合成的關(guān)鍵基因，而D-半乳糖醛酸途徑在果實(shí)發(fā)育中期對AsA合成有一定的貢獻(xiàn)。最為重要的是，循環(huán)途徑的RrDHAR在果實(shí)發(fā)育后期對DHA的還原作用是果實(shí)積累和維持高含量AsA的關(guān)鍵。此外，DHA的長距離運(yùn)輸也可能參與到果實(shí)積累As