擬南芥抗壞血酸生物合成途徑的調(diào)控機(jī)理.pdf

1、抗壞血酸(AsA)是普遍存在于生物體內(nèi)的一種高豐度水溶性小分子抗氧化物質(zhì)，在植物體中，AsA除了具有清除活性氧自由基的作用外，還在植物體光合作用、細(xì)胞發(fā)育、乙烯合成以及逆境脅迫應(yīng)答中起著重要的生物學(xué)功能。目前已經(jīng)報(bào)道AsA在植物體內(nèi)具有4條生物合成途徑，包括D-甘露糖/L-半乳糖途徑、糖醛酸途徑、古洛糖途徑和肌醇途徑等。其中，D-甘露糖/L-半乳糖途徑作為植物體內(nèi)AsA生物合成的主要途徑，對(duì)該途徑中的組份分析及功能研究已經(jīng)非常深入，但是

2、，許多關(guān)鍵酶基因的調(diào)控機(jī)理仍不清楚。本研究分別對(duì)植物激素脫落酸(ABA)和光信號(hào)復(fù)合體COP9與AsA生物合成之間的調(diào)控關(guān)系，以及D-甘露糖/L-半乳糖途徑中關(guān)鍵酶基因VTC1（GMPase，GDP-D-甘露糖焦酸化酶）5'UTR（5'Untranslated Regions，5'非翻譯區(qū)）內(nèi)含子進(jìn)行了功能分析。主要研究結(jié)果如下:
　　1.ABA處理擬南芥野生型和ABI4(ABA insensitive4)相關(guān)植株幼苗試驗(yàn)結(jié)果顯示

3、，ABI4介導(dǎo)ABA對(duì)擬南芥幼苗生長(zhǎng)和AsA的生物合成具有抑制作用，并且促進(jìn)了過氧化氫(H2O2)和超氧陰離子(O2-)等活性氧物質(zhì)(ROS)的產(chǎn)生，表明AsA和ROS與ABA對(duì)植物生長(zhǎng)的抑制作用有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥植株中內(nèi)源AsA的減少使得植株鮮重下降，ROS含量上升，但同時(shí)使用AsA處理后，能夠降低ROS的含量，并且恢復(fù)由ABA所引起的植株受抑制表型，表明AsA具有ROS清除功能并可改善ROS所導(dǎo)致的幼苗生長(zhǎng)緩慢的作用。轉(zhuǎn)錄

4、組數(shù)據(jù)分析顯示，ABA轉(zhuǎn)錄調(diào)控了4200多個(gè)基因，包括了ROS清除系統(tǒng)和AsA生物合成相關(guān)的基因。研究發(fā)現(xiàn)，ABA通過ABI4轉(zhuǎn)錄抑制AsA生物合成相關(guān)基因VTC2的表達(dá)，并且證明ABI4直接結(jié)合到VTC2啟動(dòng)子的CCAC元件上。本研究首次發(fā)現(xiàn)了ABI4能調(diào)控AsA生物合成途徑，闡釋了ABA對(duì)擬南芥幼苗生長(zhǎng)抑制作用的分子機(jī)制。
　　2.通過生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)了VTC1與CSN5B相互作用的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)Thr12(T12)、Arg

5、13(R13)和Asp27(D27)，進(jìn)而通過生物化學(xué)和遺傳學(xué)方法證明了D27是影響植物體內(nèi)VTC1與CSN5B相互作用的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。同時(shí)，通過對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行試驗(yàn)，證明了D27突變?yōu)镚lu27(E27)比突變?yōu)锳sn27(N27)更能促進(jìn)擬南芥幼苗體內(nèi)AsA含量的積累以及H2O2含量的下降，進(jìn)而促進(jìn)擬南芥幼苗的生長(zhǎng)。
　　3.研究發(fā)現(xiàn)了VTC1的5'UTR(5'Untranslated Regions，5'非翻譯區(qū))中包含1

6、個(gè)內(nèi)含子，將5'UTR和啟動(dòng)子不同刪除片段與報(bào)告基因GUS融合。通過檢測(cè)轉(zhuǎn)基因擬南芥的GUS活性發(fā)現(xiàn)，這些片段均能啟動(dòng)GUS的高表達(dá)，但將5'UTR中的內(nèi)含子刪除后，GUS的表達(dá)明顯降低，5'UTR自身并不能啟動(dòng)GUS的表達(dá)。序列分析發(fā)現(xiàn)，VTC1的5'UTR內(nèi)含子包含有多個(gè)增強(qiáng)其功能的特征序列，如GATCTG基序。同時(shí)，VTC1在擬南芥和水稻的同源基因中同樣具有5'UTR內(nèi)含子。以上結(jié)果表明，VTC1的5'UTR內(nèi)含子可能具有增強(qiáng)子的