龍眼胚性培養(yǎng)物DlRan3A和DlRan3B基因的功能分析.pdf

1、龍眼是我國(guó)南方具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的熱帶亞熱帶常綠木本果樹(shù)，龍眼生產(chǎn)上存在諸多問(wèn)題制約其產(chǎn)業(yè)發(fā)展，如缺乏具有生產(chǎn)價(jià)值的焦核品種、成熟期過(guò)于集中以及果實(shí)品質(zhì)、產(chǎn)量和貯藏受到環(huán)境因素影響。目前關(guān)于龍眼焦核、結(jié)果期調(diào)節(jié)以及抗逆性等方面的分子機(jī)制研究較少。Ran（Ras-related nuclear protein）小G蛋白廣泛參與生長(zhǎng)發(fā)育、抗病和激素敏感性調(diào)控等過(guò)程。前人研究表明，龍眼Ran可能與龍眼體胚發(fā)生（SE）過(guò)程的細(xì)胞分裂有關(guān)，但具體機(jī)

2、制尚不清楚，目前關(guān)于龍眼Ran表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究仍有大量空白，尤其是龍眼Ran基因在龍眼胚胎和果實(shí)發(fā)育過(guò)程的功能特異性以及響應(yīng)外界環(huán)境的相應(yīng)機(jī)制等。因而本研究首先分離龍眼DlRan3A和 DlRan3B基因啟動(dòng)子并驗(yàn)證其功能，并通過(guò)對(duì)龍眼體胚發(fā)生、合子胚發(fā)育以及果肉發(fā)育等過(guò)程以及龍眼不同組織器官中 DlRan3A和DlRan3B基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析，為了解Ran基因在龍眼的胚胎發(fā)育及果實(shí)發(fā)育中的作用機(jī)制提供新的線索。同時(shí)，利用異位表達(dá)、

3、原位轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)錄組分析等手段對(duì)龍眼DlRan3A和DlRan3B基因及啟動(dòng)子進(jìn)行功能分析，探索Ran在植物生長(zhǎng)發(fā)育和抗性調(diào)節(jié)等過(guò)程中的功能特異性，進(jìn)一步研究植物Ran表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。主要研究結(jié)果如下：
　　1.龍眼DlRan3A和DlRan3B基因啟動(dòng)子的克隆與生物信息學(xué)分析。以龍眼胚性愈傷組織（EC）為材料，利用Tail-PCR法和連接介導(dǎo)染色體步移法分別獲得1256bp和1569bp的DlRan3A和 DlRan3B基因啟動(dòng)子序

4、列；生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)獲得這兩個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)的核心啟動(dòng)子區(qū)域和可能的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，且DlRan3A啟動(dòng)子區(qū)存在一個(gè)長(zhǎng)度為147bp的CpG島。分析功能元件發(fā)現(xiàn)，DlRan3A和 DlRan3B基因啟動(dòng)子區(qū)均含有生長(zhǎng)素、水楊酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）響應(yīng)元件以及厭氧誘導(dǎo)和防御與脅迫響應(yīng)元件。DlRan3A基因啟動(dòng)子還含有參與傷害和病原體誘導(dǎo)的響應(yīng)元件，DlRan3B基因啟動(dòng)子區(qū)還含有赤霉素和脫落酸（ABA）響應(yīng)元件及低溫響應(yīng)元件，

5、說(shuō)明龍眼 Ran家族不同成員在激素響應(yīng)和抗逆調(diào)節(jié)方面可能存在功能特異性。
　　2.龍眼DlRan3A和DlRan3B基因啟動(dòng)子功能驗(yàn)證。構(gòu)建龍眼DlRan3A和DlRan3B啟動(dòng)子的3'和5'不同缺失突變體的表達(dá)載體，利用煙草葉片 GUS瞬時(shí)表達(dá)水平進(jìn)行啟動(dòng)子缺失分析和啟動(dòng)子激素應(yīng)答分析。結(jié)果顯示，DlRan3A和 DlRan3B基因啟動(dòng)子中，正調(diào)控和負(fù)調(diào)控元件并存，8.6μM IAA（IAA）、75μM SA或100μM MeJ

6、A誘導(dǎo)DlRan3A基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，8.6μM IAA或34.6μM GA3（GA3）激活DlRan3B基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性；基于激素應(yīng)答元件分布于 DlRan3A和DlRan3B基因啟動(dòng)子的區(qū)域，推測(cè)生長(zhǎng)素元件均為正調(diào)控作用元件；MeJA應(yīng)答元件的廣泛分布預(yù)示其復(fù)雜的調(diào)控作用；推測(cè)DlRan3A基因啟動(dòng)子的SA響應(yīng)元件、防御和逆境響應(yīng)元件以及box S元件為正調(diào)控元件，且DlRan3B基因啟動(dòng)子的SA響應(yīng)元件位于防御和逆境響應(yīng)元

7、件和低溫和干旱響應(yīng)元件為負(fù)調(diào)控元件；DlRan3A和 DlRan3B的啟動(dòng)子在參與抗逆反應(yīng)中可能發(fā)揮特異的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。
　　3.龍眼DlRan3A和DlRan3B的表達(dá)模式分析。利用qPCR分析龍眼DlRan3A和DlRan3B基因的表達(dá)模式。從龍眼DlRan3A和DlRan3B基因在龍眼不同生長(zhǎng)發(fā)育階段以及組織器官中的表達(dá)譜可知，龍眼DlRan3A和DlRan3B基因在龍眼不同組織部位中均有表達(dá)，其中二者均在龍眼種子和果肉中表

8、達(dá)量較高；在體胚發(fā)生的子葉胚時(shí)期和合子胚發(fā)育的幼嫩胚胎中表達(dá)量較高；DlRan3A和 DlRan3B基因表達(dá)量隨著種子萌發(fā)過(guò)程下降，且隨著果肉的膨大而提高。說(shuō)明龍眼DlRan3A和DlRan3B基因在龍眼胚胎（種子）發(fā)育以及果肉膨大過(guò)程中發(fā)揮更為重要的作用。不同激素及非生物脅迫處理龍眼EC下的DlRan3A和DlRan3B基因的定量表達(dá)分析結(jié)果顯示，二者的表達(dá)均受到一定濃度外源生長(zhǎng)素（IAA）、赤霉素（GA3）的誘導(dǎo)而受到高濃度SA和M

9、eJA的抑制，并且一定程度上受到鹽脅迫、滲透脅迫、PEG脅迫和 ABA脅迫的誘導(dǎo)。說(shuō)明龍眼DlRan3A和DlRan3B基因廣泛參與激素應(yīng)答和非生物脅迫響應(yīng)。
　　4.35S或特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下異位表達(dá)龍眼DlRan3A與DlRan3B基因的功能分析。構(gòu)建DlRan3A與DlRan3B亞細(xì)胞定位載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)化本氏煙葉片；構(gòu)建35S或特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)DlRan3A或DlRan3B基因過(guò)表達(dá)載體、特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá)載體及DlRa

10、n3A干擾表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化本氏煙。亞細(xì)胞定位顯示，龍眼DlRan3A和DlRan3B主要定位于細(xì)胞核。特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS表達(dá)的轉(zhuǎn)基因本氏煙幼苗（PA-GUS和PB-GUS）的GUS染色結(jié)果表明DlRan3A和DlRan3B均在細(xì)胞分裂旺盛的部位（根尖和根系分支處）表達(dá)量較高，同時(shí)，二者在果實(shí)和種子中也分布較多，此外DlRan3A相對(duì)于DlRan3B在花器官中有更顯著的表達(dá)。特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng) DlRan3A過(guò)表達(dá)的株系pCAMBIA1301

11、-pDlRan3A（1256bp）-DlRan3A（PA_A）表現(xiàn)出植株矮壯，開(kāi)花推遲，果實(shí)發(fā)育異常且結(jié)籽率低的現(xiàn)象，說(shuō)明龍眼特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng) DlRan3A過(guò)表達(dá)對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育尤其是調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)周期以及果實(shí)和種子發(fā)育有顯著影響。PA_A株系的根系中主根相對(duì)不明顯，且根毛發(fā)育旺盛，推測(cè) DlRan3A基因與根毛發(fā)育密切相關(guān)。干擾表達(dá) DlRan3A基因的本氏煙株系（ran3a）表現(xiàn)出生長(zhǎng)極其緩慢、花果發(fā)育異常且不結(jié)籽的現(xiàn)象，說(shuō)明龍眼Ran

12、基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮至關(guān)重要作用。過(guò)表達(dá) DlRan3A基因株系pCAMBIA1301-35S-DlRan3A（P35S_A）和PA_A相對(duì)于野生型植株（WT）有較高的抗非生物脅迫（鹽脅迫、滲透脅迫、干旱脅迫和熱脅迫）能力；相反，過(guò)表達(dá) DlRan3B基因株系 pCAMBIA1301-35S-DlRan3B（P35S_B）和（pCAMBIA1301-pDlRan3B（1569bp）-DlRan3B（PB_B）的抗性相對(duì)較弱，其中P3

13、5S_B株系對(duì)鹽脅迫、滲透脅迫、干旱脅迫和熱脅迫的耐受性均弱于WT，且對(duì)鹽脅迫和滲透脅迫高度敏感；相同的是，過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的抗冷脅迫能力得到提高，且均對(duì)外源ABA高度敏感，說(shuō)明龍眼DlRan3A和DlRan3B基因與冷脅迫抗性和ABA信號(hào)通路密切相關(guān)。
　　5.35S或特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下異位表達(dá)龍眼DlRan3A和DlRan3B的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)35S或特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下過(guò)表達(dá)龍眼DlRan3A和 DlRan3B的

14、本氏煙株系進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)株系中存在顯著上調(diào)或下調(diào)的生長(zhǎng)素信號(hào)通路相關(guān)差異基因，說(shuō)明龍眼Ran可能存在復(fù)雜作用機(jī)制影響生長(zhǎng)素信號(hào)通路的調(diào)控；參與 ABA運(yùn)輸?shù)牟糠植町惢蝻@著上調(diào)，結(jié)合ABA脅迫表型可知，龍眼Ran過(guò)表達(dá)顯著影響植株對(duì)外源ABA的應(yīng)答能力。BR（brassinosteroid）正調(diào)控基因顯著上調(diào)，而負(fù)調(diào)控BR合成的基因顯著下調(diào)，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)BR含量增多或BR信號(hào)輸出增強(qiáng)。過(guò)表達(dá)龍眼Ran基因的4種轉(zhuǎn)基因株系

15、中絕大多數(shù)細(xì)胞壁蛋白上調(diào)表達(dá)，可見(jiàn)龍眼DlRan3A和 DlRan3B基因可能通過(guò)影響龍眼細(xì)胞壁物質(zhì)的積累以參與調(diào)控龍眼生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，尤其是早期胚胎及果肉發(fā)育過(guò)程。
　　過(guò)表達(dá)龍眼Ran的株系顯著富集碳水化合物代謝和丙氨酸、谷氨酸和天冬酰胺代謝通路；P35S_A株系還存在過(guò)氧化物為受體的氧化還原酶活性的通路；PA_A株系還存在參與細(xì)胞壁組織、結(jié)構(gòu)成分和生物合成、纖維素生物合成及代謝、葡聚糖代謝、外包結(jié)構(gòu)組織等通路；PA_A與P35

16、S_A株系相比以及PB_B與P35S_B株系相比，均顯著富集細(xì)胞壁組織、結(jié)構(gòu)成分和生物合成通路，包含的基因均為3個(gè)extensin-like家族的Pollen Ole e1結(jié)構(gòu)域基因，然而在PA-A株系中為顯著上調(diào)基因而在PB_B株系中為顯著下調(diào)基因；結(jié)合表型分析可知，特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)DlRan3A過(guò)表達(dá)通過(guò)提高部分extensin-like基因水平從而影響植株根毛、果實(shí)和種子發(fā)育，說(shuō)明龍眼Ran特異啟動(dòng)子在參與器官細(xì)胞壁組織結(jié)構(gòu)及生物合

17、成方面可能發(fā)揮特異的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。
　　過(guò)表達(dá)龍眼 Ran的株系中存在較多編碼過(guò)氧化物酶（PER）、水通道蛋白（TIP）、谷氨酰胺合成酶（AS）、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）、熱激蛋白（HSP）及其伴侶蛋白（DNAJ）等的植物抗性相關(guān)基因和編碼MYB、NAC、WRKY、ERF、GRAS及bHLH等抗性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因，可見(jiàn)龍眼Ran與抗性調(diào)節(jié)密切相關(guān)。過(guò)表達(dá)DlRan3A基因的株系呈現(xiàn)比過(guò)表達(dá)DlRan3B基因的株系更強(qiáng)的耐非生物脅迫

18、能力，一方面在于 P35S_A和 PA_A株系中部分增強(qiáng)植物抗性的基因（如PER、GST、OLP、TIS、PPO和 BG等）顯著上調(diào)，另一方面在于P35S_B和PB_B株系有大量植物抗性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（如ERF、WRKY、bHLH、C3H、C2H2和GRAS等）基因顯著下調(diào)。
　　6.DlRan3A與DlRan3B基因原位轉(zhuǎn)化龍眼的功能分析。在過(guò)表達(dá)龍眼 DlRan3A或 DlRan3B基因的原位轉(zhuǎn)化株系中， CESA6、EXLA2

19、和EXT3等細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和合成相關(guān)基因的表達(dá)量均顯著提高；MYB59、DlPPO1和TIP1-1等抗性相關(guān)基因的表達(dá)量也均顯著提高；驗(yàn)證了過(guò)表達(dá)龍眼Ran基因引起的細(xì)胞壁合蛋白基因和抗性基因差異表達(dá)結(jié)果，進(jìn)一步說(shuō)明龍眼Ran基因與細(xì)胞壁合成和抗性調(diào)節(jié)等過(guò)程密切相關(guān)。
　　綜上所述，本研究分離了DlRan3A和DlRan3B基因啟動(dòng)子并分析了二者在參與激素應(yīng)答和抗性調(diào)節(jié)等過(guò)程存在的功能特異性；龍眼DlRan3A和DlRan3B基因是龍

20、眼生長(zhǎng)發(fā)育所必需的重要小G蛋白基因，尤其在龍眼胚胎（種子）發(fā)育和果肉發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用；龍眼Ran可能參與生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、ABA和BR等激素信號(hào)通路的調(diào)控。異位表達(dá)龍眼Ran提高植株對(duì)外源ABA的敏感性，且提高植株抗寒能力；異位表達(dá)龍眼 DlRan3A提高植株抗非生物脅迫能力，特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)DlRan3A表達(dá)通過(guò)提高部分extensin-like基因水平，從而影響根毛、果實(shí)和種子發(fā)育；龍眼Ran基因與細(xì)胞壁合成和抗性調(diào)節(jié)等過(guò)程密