利用mRNA差異顯示技術(shù)克隆球孢白僵菌在蟬蛻和蠶血淋巴誘導(dǎo)下的特異表達(dá)基因.pdf

1、隨著人們對(duì)環(huán)境保護(hù)認(rèn)識(shí)的加深，由化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生的3R問題已經(jīng)越來(lái)越受到重視。利用生物殺蟲劑控制害蟲已經(jīng)是不可逆轉(zhuǎn)的趨勢(shì)。蟲生真菌作為農(nóng)林生態(tài)系中昆蟲的重要致死因子，由于其對(duì)環(huán)境相容，不易產(chǎn)生抗藥性，以及資源豐富，開發(fā)成本較低等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被作為控制害蟲爆發(fā)的重要因子。但是，其應(yīng)用仍然存在諸多缺點(diǎn)，如藥效慢，環(huán)境適應(yīng)性差等。因此，如何提高球孢白僵菌的毒力與抗逆性始終是業(yè)內(nèi)研究的熱點(diǎn)。
　　 要改造和構(gòu)建高毒、速效、穩(wěn)定的新型白僵菌菌株

2、，必須了解白僵菌侵染昆蟲的機(jī)制與機(jī)理。本研究以球孢白僵菌為研究對(duì)象，通過(guò)模擬球孢白僵菌侵染昆蟲的過(guò)程，分析在侵染過(guò)程中球孢白僵菌的分子對(duì)策，試圖發(fā)現(xiàn)了一些與侵染過(guò)程相關(guān)的基因。
　　 首先，本研究對(duì)白僵菌進(jìn)行液體培養(yǎng)，并加入蟬蛻和蠶血淋巴進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)24h，分別提取誘導(dǎo)菌絲的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，加入差異顯示引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PAGE膠電泳后，將膠上的差異條帶割膠回收，克隆測(cè)序。通過(guò)Blast序列比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：9個(gè)與昆

3、蟲侵染機(jī)制相關(guān)的基因序列，27個(gè)假定蛋白基因序列，5個(gè)未知序列；其中與侵染過(guò)程相關(guān)的表達(dá)基因，包括：蛋白酶成熟因子、尿囊通透酶、膜上G蛋白、以及第二信使cAMP等編碼基因。這些基因在血淋巴和蟬蛻誘導(dǎo)與對(duì)照處理下，均存在差異表達(dá)。
　　 其次，本研究進(jìn)一步利用real-time PCR技術(shù)對(duì)蛋白酶成熟因子的表達(dá)進(jìn)行了精確驗(yàn)證；結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在蟬蛻誘導(dǎo)條件下，與對(duì)照處理相比，該基因的表達(dá)量為上調(diào)了8倍左右。
　　 本研究通過(guò)mR