椒樣薄荷病毒種類的分子鑒定及檢測研究.pdf

1、椒樣薄荷是新疆的一種香料植物，隨著種植年限的增加，椒樣薄荷精油品質(zhì)和產(chǎn)量逐漸下降。本實(shí)驗(yàn)對椒樣薄荷病毒進(jìn)行了分子鑒定，并建立相應(yīng)的檢測方法，為椒樣薄荷無毒化栽培及生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。
　　從田間采集表現(xiàn)明顯病毒癥狀的椒樣薄荷病株，采用纖維素（CF-11）層析方法，對椒樣薄荷植株中的病毒dsRNA進(jìn)行分離，利用改進(jìn)的單引物法擴(kuò)增到一段約400bp產(chǎn)物，然后對其進(jìn)行克隆與測序。得到該片段核苷酸序列為352bp，序列分析表明為黃瓜花葉病毒

2、（CMV）1a基因的部分序列，與其它已報道CMV1a基因序列同源性高達(dá)96％。
　　根據(jù)所獲病毒信息，設(shè)計了3對針對CMV2a基因、2b基因和CP基因特異性引物，對病株進(jìn)行了相應(yīng)目標(biāo)基因的RT-PCR，結(jié)果均擴(kuò)增到預(yù)期的目標(biāo)片段。利用間接ELISA從186個樣品中檢測出3個樣品呈陽性。并利用免疫反轉(zhuǎn)錄PCR（IC-RT-PCR）從分離物MP1中檢測到CMV，通過體系優(yōu)化，建立了針對CMV的IC-RT-PCR檢測體系，該體系病毒粗提

3、液的稀釋限點(diǎn)為10-6。
　　根據(jù)CMVRNA3基因組全長設(shè)計特異引物從分離物MP1中擴(kuò)增到目標(biāo)片段，將其進(jìn)行克隆和測序，得到2189個核苷酸，序列分析表明，該序列與其它已報道CMVRNA3組分核苷酸序列同源性達(dá)到90%以上；包含2個分別編碼3a基因和CP基因的開放閱讀框。3a基因?yàn)?38個核苷酸，編碼一個由279個氨基酸組成的蛋白質(zhì)（分子量為30.6kDa），與其它已報道CMV的RNA核苷酸同源性為93.4%～96.9%，氨基酸