膠質類芽孢桿菌3016全基因組測序及菌種水平特異分子標識的篩選和鑒定.pdf

1、膠質類芽孢桿菌（Paenibacillus mucilaginosus）是微生物肥料廣泛應用的功能菌種之一，菌體自身通過代謝產生有機酸、氨基酸、多糖、激素等物質促進植物的生長，并且能夠分解含鉀礦物，釋放出鉀及其他營養(yǎng)元素，有些菌株還具備溶磷和固氮功能。膠質類芽孢桿菌在農業(yè)生產中表現(xiàn)出提高土壤速效鉀與速效磷含量、促進作物生長、提高作物產量和品質等多方面的效應，一直是微生物肥料研發(fā)的重點和熱點之一。
　　 本論文以實驗室分離得到14

2、株膠質類芽孢桿菌為實驗材料，進行了形態(tài)學觀察、生理生化測定、16SrDNA和gyr B基因測序、系統(tǒng)發(fā)育分析。通過溶磷、解鉀、固氮等生物學功能的測定比較，從中篩選得到了一株高效多功能優(yōu)良菌株，編號為P.Mucilaginosus 3016。該菌株的溶磷、解鉀效果分別比對照增加至187.8％和131.4％，固氮酶活性為3.51nmol（C2H4）/h·mg（蛋白），發(fā)酵液中產生的蘋果酸和乙酸分別比對照增加89.9％和277.7％，同時產生

3、少量檸檬酸（3.74mg/L）、生長素（0.03mg/L）和赤霉素（1.01mg/L），對植株具有一定的促生能力。
　　 采用Sanger測序方法與454高通量測序相結合的方法，對P.Mucilaginosus 3016菌株全基因組序列進行測序，利用SOAP de novo v1.04、454 Newbler v2.3軟件進行序列的拼接，獲得全基因組序列精細圖譜。通過基因組序列拼接、空缺填補和低質量序列校驗等工作后，繪制了301

4、6菌株全基因組序列圖譜，并應用生物信息學方法對基因組進行了注釋。
　　 利用比較基因組學分析手段，根據(jù)3016菌株全基因組序列，選擇膠質類芽孢桿菌特異性片段為靶基因，設計特異性引物。通過PCR條件的優(yōu)化和特異性、靈敏度的驗證，篩選得到一對膠質類芽孢桿菌的特異引物（orf06701-F：5'-ATGGAGGAAACATG GGGTGA-3'/orf06701-R：5'-TCAGGAATGAAGGCCCCCTT-3'），建立了膠質類

5、芽孢桿菌快速鑒別方法。研究表明，該引物僅能在以膠質類芽孢桿菌為模板時特異性擴增333bp保守序列，其檢出靈敏限度為每微升反應體系400-1000個細胞，以實驗選取的其他參比菌株為模板時并不能擴出該序列，該引物具有良好的特異性；同時，用該方法成功地鑒定了從土壤中分離得到的膠質類芽孢桿菌，并且得到的特異性片段序列同源性達到100％。
　　 本文對一株P.Mucilaginosus 3016進行全基因組測序，該菌株是一株具有溶磷、解鉀