蘿卜屬和蕓薹屬中的種傳雙鏈RNA病毒的研究.pdf

1、病毒和宿主在長(zhǎng)期的互作博弈過(guò)程中，形成了急性侵染和慢性侵染兩類(lèi)。關(guān)于持續(xù)的慢性侵染的研究，一直以來(lái)被人們所忽視，但近年來(lái)相關(guān)研究日漸增多。這類(lèi)不引起明顯癥狀的持續(xù)侵染相關(guān)的病毒中，報(bào)道最早也最多的是一大類(lèi)主要侵染真菌和植物、甚至某些動(dòng)物的基因組為dsRNA病毒。目前，此類(lèi)病毒來(lái)自不同的科屬，分屬于整體病毒科（Totiviridae）、雙分病毒科（Partitiviridae）、青霉病毒科（Chrysoviridae）和內(nèi)生RNA病毒科（

2、Endornaviridae）以及最近新劃分出的小雙RNA病毒（Picobirnaviradae）等4個(gè)科。植物中此類(lèi)病毒被稱(chēng)為隱潛性病毒，此前有證據(jù)表明蕓薹屬作物中可能存在隱潛性病毒，且蘿卜中已有多種雙分病毒被報(bào)道。本論文通過(guò)dsRNA診斷技術(shù)對(duì)蘿卜屬和蕓薹屬種的種傳隱潛性dsRNA病毒進(jìn)行了調(diào)查，并建立了基于不同品種dsRNA多樣性差異表征宿主群體遺傳多樣性的分子標(biāo)記方法。并且我們獲得了蘿卜屬和蕓薹屬中相關(guān)病毒的全基因組序列，且對(duì)其

3、分類(lèi)學(xué)地位和進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了探討。具體研究結(jié)果如下:
　　 1、通過(guò)對(duì)蕓薹屬和蘿卜屬7個(gè)種26個(gè)不同品種帶種傳dsRNA情況進(jìn)行診斷調(diào)查，共發(fā)現(xiàn)五類(lèi)不同的dsRNA，且通過(guò)低溫處理和組織培養(yǎng)再生均無(wú)法從植物體內(nèi)消除，臺(tái)盼藍(lán)染色光鏡觀察葉片組織，未發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌和共生菌，這些均表明這些dsRNA來(lái)自植物本身而非真菌。根據(jù)大小和帶型關(guān)系，這些dsRNA分別命名為ds1500，ds1600，ds1800，ds1900和ds3500，推測(cè)至

4、少對(duì)應(yīng)于5類(lèi)不同的種傳RNA病毒。不同種、乃至不同品種、以及同品種內(nèi)的不同個(gè)體間攜帶dsRNA類(lèi)型存在著差異，我們對(duì)這種差異性進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)蘿卜屬各品種間和內(nèi)部的dsRNA帶型多樣性遠(yuǎn)高于蕓薹屬，且ds1800，ds1900均只特異性的出現(xiàn)在蘿卜屬中;ds1500幾乎存在于所有蕓薹屬和蘿卜屬品種，ds3500在某些蘿卜屬品種和一部分蕓薹屬作物中均有出現(xiàn)。
　　 2、利用不同品種和種之間dsRNA多態(tài)性的差異作為宿主遺傳距離

5、分析的分子標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)基于品種間dsRNA帶型差異的聚類(lèi)分析僅能很好的區(qū)分屬水平的類(lèi)群，而種內(nèi)多樣性指標(biāo)聚類(lèi)以及品種dsRNA差異和種內(nèi)多樣性?xún)深?lèi)指標(biāo)的綜合運(yùn)用在區(qū)分屬水平上的類(lèi)群的同時(shí)，也能區(qū)分蘿卜各品種和部分蕓薹屬品種，且可靠程度更高。由于蘿卜各品種間以及品種內(nèi)dsRNA帶型的高多樣性，基于帶型多態(tài)性的宿主遺傳多樣性分析對(duì)于區(qū)分蘿卜種質(zhì)資源十分有益。蕓薹屬類(lèi)群dsRNA帶型相對(duì)蘿卜屬單一，此類(lèi)群內(nèi)的種質(zhì)無(wú)法運(yùn)用此方法準(zhǔn)確區(qū)分，但是可有

6、效篩選某些可能和蘿卜屬有著最近共同細(xì)胞型祖先的品種，這些對(duì)于蕓薹屬和蘿卜屬種質(zhì)資源、遺傳結(jié)構(gòu)和進(jìn)化關(guān)系的研究提供了一個(gè)全新的視角和分析依據(jù)。而且我們的研究結(jié)果和蘿卜的雜交起源假說(shuō)是一致的。
　　 3、通過(guò)ds3500對(duì)應(yīng)的dsRNA進(jìn)行全序列克隆測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其由三條大小分別為3638，3517和3299bp的dsRNA分子組成，三者具有保守的末端非編碼區(qū)，且各含有一個(gè)大的開(kāi)放閱讀框，分別編碼和青霉病毒科關(guān)系較近的病毒復(fù)制酶，外殼蛋

7、白和蛋白酶。含有ds3500的短葉13蘿卜葉片中可以提取到直徑約45nm病毒粒子，從病毒粒子中提取基因組核酸雜交驗(yàn)證了這3條dsRNA即為這一新病毒的基因組。臺(tái)盼藍(lán)染色未發(fā)現(xiàn)與D13共生的真菌，低溫處理未能消除此病毒，這些均表明，這個(gè)病毒為侵染蘿卜的青霉病毒而不是來(lái)自其共生菌,因此我們把它命名為蘿卜青霉病毒1(Raphanussativuschrysovirus1，RasCV1)。基于3條序列與其它已報(bào)道的青霉病毒和NCBIgenban

8、k數(shù)據(jù)庫(kù)潛在的青霉病毒序列的系統(tǒng)發(fā)生分析發(fā)現(xiàn)，RasCV1應(yīng)被歸類(lèi)到青霉病毒科，且RasCV1和其他可能的未報(bào)道的存在于植物的青霉病毒（包括通過(guò)本研究檢索到的相關(guān)序列信息）形成一個(gè)新的類(lèi)群。我們利用RasCV1的3條基因組序列對(duì)NCBIgenbank數(shù)據(jù)庫(kù)和表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫(kù)檢索分析發(fā)現(xiàn)，青霉病毒類(lèi)病毒可能廣泛存在于單子葉植物和雙子葉植物，而且某些病毒的基因組片段整合進(jìn)了宿主基因組DNA。RasCV1是第一個(gè)公開(kāi)報(bào)道的分離自植物的青霉病

9、毒科病毒。
　　 4、為了充分認(rèn)識(shí)廣泛存在于蕓薹屬和蘿卜屬中的大小在1500-2000bp的dsRNA對(duì)應(yīng)的病毒，為研究病毒在蕓薹屬作物中的傳播和與宿主作物的互作奠定基礎(chǔ)，我們通過(guò)單引物擴(kuò)增技術(shù)獲得了蘿卜中ds1900對(duì)應(yīng)的病毒的基因組，獲得了菜薹ds1500對(duì)應(yīng)病毒的外殼蛋白全序列，以及克隆了臨洮白芥中ds1600對(duì)應(yīng)的病毒的全基因組序列。推測(cè)編碼蛋白后，對(duì)Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)的進(jìn)行搜索獲得相似序列，然后進(jìn)行比較與分析，預(yù)測(cè)目

10、的序列所編碼蛋白的功能。分析發(fā)現(xiàn)這些序列對(duì)應(yīng)的三種不同的雙分病毒，分別命名為Raphanussativuspartitivirus1，Brassicarapacrypticvirus1和Sinapisalbacrypticvirus1，系統(tǒng)發(fā)生分析表明三者的親緣關(guān)系均相對(duì)較遠(yuǎn)，分屬于雙分病毒科不同亞族。
　　 5、一般雙分病毒的基因組由兩條分別編碼病毒復(fù)制酶和外殼蛋白dsRNA組成。近年來(lái)，多種由3條基因組dsRNA組成的三分體

11、雙分病毒被發(fā)現(xiàn)，但第三條dsRNA的起源很少提及。我們對(duì)五種已報(bào)道的三分體雙分病毒的第二條dsRNA（dsRNA2）和第三條dsRNA(dsRNA3)的開(kāi)放閱讀框和編碼的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)系統(tǒng)發(fā)生分析表明，發(fā)現(xiàn)同種病毒的dsRNA2和dsRNA3有著很高的相似關(guān)系，即它們兩兩聚合在一起，而不是dsRNA2和dsRNA3分別聚類(lèi)為兩大不同分支。這表明，dsRNA3和dsRNA3有著最近的同源關(guān)系，即起源于同一個(gè)祖先。最后，根據(jù)共侵染病毒重配