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文檔簡介
1、茶是目前世界上飲用量最大的非酒精類飲料,L-茶氨酸是茶樹體內(nèi)特征性非蛋白質(zhì)氨基酸,不僅決定了茶的風(fēng)味還有非常廣泛的藥理作用。茶氨酸合成酶(Theanine synthetase,TS)不僅是茶氨酸合成的關(guān)鍵酶,也對(duì)茶樹體內(nèi)的氮代謝有重大影響。研究表明,茶氨酸合成酶基因序列與谷氨酰胺合成酶(Glutaminesynthetase,GS)基因序列有高度同源性,有可能是谷氨酰胺合成酶基因家族成員,對(duì)其進(jìn)行研究,不僅有利于掌握茶氨酸代謝與調(diào)控的
2、規(guī)律,也有助于了解茶樹體內(nèi)氮同化與轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)理。本研究利用RT-PCR的方法克隆了茶樹體內(nèi)茶氨酸合成酶基因(DD410895)與谷氨酰胺合成酶基因(AB115184),通過原核與真核表達(dá)進(jìn)行功能驗(yàn)證,并將原核表達(dá)的蛋白純化以制備多抗;在此基礎(chǔ)上,利用生物信息學(xué)的手段對(duì)TS與GS推導(dǎo)出的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)與功能的分析,并利用系統(tǒng)進(jìn)化樹的方法對(duì)它們?cè)贕S基因家族中的地位進(jìn)行聚類分析;利用HPLC檢測(cè)與Western Blotting相結(jié)合的方
3、法對(duì)不同NO誘導(dǎo)處理下茶籽苗中TS的表達(dá)與茶氨酸的積累進(jìn)行分析。通過上述研究得到以下結(jié)果:
通過提取茶樹根部與葉部總RNA,進(jìn)行RT-PCR,克隆得到茶樹茶氨酸合成酶基因(DD410895)與谷氨酰胺合成酶基因(AB115184)。獲得的TS基因長度為1071bp,與已知的茶樹TS基因的氨基酸序列有3個(gè)氨基酸的差異,與其他植物GS基因具有較高的同源性,獲得的GS基因與已知的茶樹GS基因的氨基酸序列有1個(gè)氨基酸的差異。對(duì)兩條
4、基因進(jìn)行原核表達(dá)后得到可溶性蛋白,進(jìn)行酶活力驗(yàn)證,結(jié)果表明,表達(dá)的TS蛋白能夠催化谷氨酰胺與鹽酸乙胺合成茶氨酸,而不能催化谷氨酸與鹽酸乙胺合成茶氨酸,也不具備GS的催化活力,酶促反應(yīng)產(chǎn)生的產(chǎn)物用HPLC與ESI-MS進(jìn)行鑒定,確定為茶氨酸;而表達(dá)的GS蛋白明顯具有轉(zhuǎn)氨基的催化活力,相較于細(xì)菌本身GS催化能力大大增強(qiáng)。
構(gòu)建植物雙元表達(dá)載體pGREEN-35S-TS/GS,導(dǎo)入農(nóng)桿菌,運(yùn)用花序侵染法轉(zhuǎn)入擬南芥,分別獲得轉(zhuǎn)茶T
5、S和GS基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥,通過除草劑Basta對(duì)后代進(jìn)行篩選,并利用PCR的方法對(duì)陽性植株進(jìn)行鑒定。利用載體上的GFP標(biāo)簽對(duì)轉(zhuǎn)TS基因的擬南芥根尖細(xì)胞進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)融合蛋白主要存在于細(xì)胞質(zhì)中。
用Expasy軟件包和CBS,Swiss-Model,InterProScan等網(wǎng)站的在線分析工具對(duì)TS與GS的理化特性,蛋白結(jié)構(gòu)等進(jìn)行分析與預(yù)測(cè)。結(jié)果表明TS的理論等電點(diǎn)PI=5.52,蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量MW=3
6、9306.3Da,GS的理論等電點(diǎn)PI=6.13,蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量MW=39240.3Da,二者均為易溶、親水性強(qiáng)的蛋白,不存在跨膜結(jié)構(gòu)。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明二者都是混合型蛋白結(jié)構(gòu)差異不大。氨基酸序列和結(jié)構(gòu)分析顯示TS與GS蛋白均包含了一個(gè)GS beta-Grasp 結(jié)構(gòu)域和一個(gè)GS催化結(jié)構(gòu)域,這些功能區(qū)在植物的谷氨酰胺合成酶中是保守的,均為Gln-synt結(jié)構(gòu)域。運(yùn)用軟件對(duì)蛋白的細(xì)胞定位和功能分析表明,TS與GS蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi),
7、具有轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的概率較高。運(yùn)用同源建模軟件SWISS-PdbView對(duì)TS三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),并以玉米GS蛋白三維結(jié)構(gòu)為模板(編號(hào):2d3a)用metapocket軟件對(duì)TS蛋白活性中心進(jìn)行分析,預(yù)測(cè)出三個(gè)酶反應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn),其位置與GS大致相當(dāng),但是其所能結(jié)合的氨基酸位點(diǎn)有著細(xì)微的差別,可能就是二者催化反應(yīng)差異的原因所在。運(yùn)用Mega4.1軟件構(gòu)建了GS的系統(tǒng)進(jìn)化樹,表明TS屬于GS家族成員,并且可以將山茶屬GS蛋白劃分
8、為3類。
利用外源一氧化氮(NO)供體硝普鈉(SNP)提供不同濃度的NO處理幼嫩茶籽苗,發(fā)現(xiàn)能夠明顯促進(jìn)TS的表達(dá)和茶氨酸的積累,短期內(nèi)NO濃度的提高能明顯增強(qiáng)茶籽苗體內(nèi)茶氨酸的含量,但是達(dá)到一定的臨界值后這種作用不再呈正相關(guān),而處理一段時(shí)間后,NO的刺激作用明顯被茶籽苗自身生長發(fā)育過程所調(diào)節(jié),茶氨酸的積累量逐步下降,使用NO清除劑與NOS抑制劑能明顯阻斷外源NO的刺激作用,但不會(huì)影響茶籽苗茶氨酸的合成與代謝的正常通路。說
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