遺傳密碼的破譯中的一個(gè)問題

1、<p>　　遺傳密碼的破譯中的一個(gè)問題</p><p><b>　　遺傳密碼的破譯</b></p><p>　　自從“一基因一酶”學(xué)說建立（1941年）以后，人們逐步地認(rèn)識到基因和蛋白的關(guān)系?！爸行姆▌t”提出后更為明確地指出了遺傳信息傳遞的方向，總體上來說是從DNA→RNA→蛋白質(zhì)。那么DNA和蛋白質(zhì)之間究竟是什么關(guān)系？或者說DNA是如何決定蛋白質(zhì)？這個(gè)有趣

2、而深?yuàn)W的問題在五十年代末就引起了人們的極大興趣。早在1944年理論物理學(xué)家Erwin Schriodinger發(fā)表的《什么是生命》一書中就大膽地預(yù)言，染色體是由一些同分異構(gòu)的單體分子連續(xù)所組成。這種連續(xù)體的精確性組成了遺傳密碼。他認(rèn)為同分異構(gòu)單體可能作為一般民用的莫爾斯電碼的兩個(gè)符號：“·”、“—”，通過排列組合來儲存遺傳信息。此時(shí)遺傳物質(zhì)的化學(xué)本質(zhì)尚未確定，同年Avery雖成功地完成了體外轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，但尚未改變?nèi)藗冋J(rèn)為蛋白質(zhì)是

3、遺傳物質(zhì)的傳統(tǒng)觀念。十年后DNA雙螺旋模型才得以建立，在這樣的背景下能將遺傳信息設(shè)想成一種電碼式的遺傳密碼形式，實(shí)在是一種超越時(shí)代的遠(yuǎn)見卓識。1953年雙螺旋模型的建立，給予科學(xué)家們以很大的激勵(lì)。破譯遺傳密碼也就成了勢在必行的工作。</p><p>　　薛丁諤（E Schriodinger）（1887～1963）要破譯一個(gè)未知的密碼，一般的思路就是比較編碼的信息，即密碼和相應(yīng)的譯文。對于遺傳密碼來說最簡單的破譯方

4、法應(yīng)是將DNA順序或mRNA順序和多肽相比較。但和一般破譯密碼不同的是，遺傳信息的譯文——蛋白的順序是已知的，未知的都是密碼。1954年Sanger用紙層析分析了胰島素的結(jié)構(gòu)后，對蛋白質(zhì)的氨基酸序列了解得越來越多。但是直到1965年前后經(jīng)歷了十年時(shí)間，多位科學(xué)家的執(zhí)著研究才破譯了遺傳密碼，其中最為重要的幾項(xiàng)工作其思路之新穎，方法之精巧都閃爍著科學(xué)的智慧之光。</p><p>　　一. 遺傳密碼的試拼　

5、1954年科普作家Gamov, G.對破譯密碼首先提出了挑戰(zhàn)。他以著有《奇異王國的湯姆金斯》等優(yōu)秀的科學(xué)幻想作品而著稱，具有豐富的想象力，但他不是一位實(shí)驗(yàn)科學(xué)家，所以只能從理論上來嘗試密碼的解讀。他在《Nature》雜志首次發(fā)表了遺傳密碼的理論研究的文章，指出“氨基酸正好按DNA的螺旋結(jié)構(gòu)進(jìn)入各自的洞穴”。他設(shè)想若一種堿基與一種氨基酸對應(yīng)的話，那么只可能產(chǎn)生4種氨基酸，而已知天然的氨基酸約有20種，因此不可能由一個(gè)堿基編碼一種氨基酸。若

6、2 個(gè)堿基編碼一種氨基酸的話，4種堿基共有4 2 =16種不同的排列組合,也不足以編碼20種氨基酸。因此他認(rèn)為3個(gè)堿基編碼一種氨基酸的就可以解決問題。雖然4個(gè)堿基組成三聯(lián)密碼，經(jīng)排列組合可產(chǎn)生43=64種不同形式，要比20種氨基酸大兩倍多，但若是四聯(lián)密碼，就會(huì)產(chǎn)生44=256種排列組合。相比之下只有三聯(lián)體（triplet）較為符合20種氨基酸。后來的實(shí)驗(yàn)證實(shí)這一推測是完全正確的。但人們不禁要問在三聯(lián)體中的每個(gè)堿基作為信息只讀一次還是重復(fù)

7、閱讀呢？Gamov也許是考慮到效率的問題，認(rèn)為一個(gè)堿基可能被重復(fù)讀多次，也就是說遺傳密碼的閱讀是</p><p>　　1961年Crick和Brenner,S.等設(shè)計(jì)了一個(gè)實(shí)驗(yàn)，有力地證實(shí)了三聯(lián)密碼的真實(shí)性。他們用T4染色體上的一個(gè)基因（rⅡ位點(diǎn)）通過用原黃素（proflavin）處理，可以使A插入或刪除單個(gè)堿基，插入叫“加字”突變，刪除叫“減字”突變，無論加字和減字都可以引起移碼突變（圖14-1）。Crick小

8、組用這種方法獲得一系列的T4“加字”和“減字”突變，再進(jìn)行雜交來獲得加入或減少2個(gè)、3個(gè)不同堿基數(shù)的系列突變。悉尼·布雷內(nèi)（S.Brenner,）（1927～）開始用原黃素誘導(dǎo)的突變稱FCO，它們只能在E.coli B菌株上生長形成噬菌斑，而不能在K菌株上生長，然后他們再用原黃素誘導(dǎo)產(chǎn)生回復(fù)突變，在E.coli K（λ）菌株中出現(xiàn)了噬菌斑。用遺傳學(xué)的方法和野生型雜交分析這些“回復(fù)突變體”，發(fā)現(xiàn)它們并不是真正

9、的野生型。表明此回復(fù)突變并非是突變位點(diǎn)又精確地回復(fù)到原來的狀況，實(shí)際上這種所謂回復(fù)突變是在不同位點(diǎn)發(fā)生第二次突變而引起的。這種第二次突變“抑制”了原來FCO的表達(dá)。這種突變稱校正突變或抑制突變（suppressor mutation），它可抵消或抑制前一次突變的效應(yīng)，校正突變的特點(diǎn)如下：　</p><p>　　就在1959年，尼倫伯格也對遺傳密碼產(chǎn)生了巨大興趣，部分原因在于這個(gè)問題充滿了挑戰(zhàn)，極大地吸引了他的求

10、知欲。尼倫伯格想知道RNA是否是遺傳物質(zhì)DNA與功能物質(zhì)蛋白質(zhì)之間的信使或者說中介分子，但是尼倫伯格未受過正規(guī)的分子遺傳學(xué)訓(xùn)練，只是業(yè)余時(shí)間學(xué)習(xí)了少許相關(guān)知識。因此，他開始向周圍有相關(guān)研究背景的同事請教。當(dāng)同事獲知尼倫伯格的研究計(jì)劃時(shí)，都紛紛勸他放棄，他們認(rèn)為對于缺乏分子遺傳學(xué)背景的生物化學(xué)家而言，開始一個(gè)全新領(lǐng)域顯得非常幼稚，其中一個(gè)同事甚至認(rèn)為尼倫伯格的決定無異于“學(xué)術(shù)自殺”。尼倫伯格仍堅(jiān)持著自己的想法，著手進(jìn)行遺傳密碼方面的研究工

11、作，特別是1960年馬特伊（J. Matthaei）的到來更是加速了遺傳密碼的研究。馬特伊來自德國波恩大學(xué)，當(dāng)時(shí)正在康奈爾大學(xué)進(jìn)行博士后研究，他非常善于實(shí)驗(yàn)研究，熟練的操作對尼倫伯格的成功是一個(gè)極大保障。</p><p>　　為了破譯遺傳密碼，1961年尼倫伯格首先需要建立一個(gè)穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)體系，而對生物化學(xué)研究背景的他而言，無細(xì)胞體系最為理想。在嘗試了幾種生物后，尼倫伯格最終選定大腸桿菌無細(xì)胞體系作為研究對象。他首

12、先想搞清楚的是DNA還是RNA直接指導(dǎo)了蛋白質(zhì)的合成。尼倫伯格先制備了大腸桿菌無細(xì)胞體系. </p><p>　　他們的方法是：?、偃ツ０澹河肈Nase處理E.coli抽提物，使DNA降解，除去原有的細(xì)菌模板。在抽提物中含有核糖體，ATP及各種氨基酸，除mRNA以外，是一個(gè)完整的翻譯系統(tǒng)。由于DNA被降解，所以不再轉(zhuǎn)錄新的mRNA，即使原來殘留的的mRNA因其半衰期短，也很快會(huì)降解掉。②加入poly U： Ni

13、renberg成功地破壞了翻譯系統(tǒng)中的內(nèi)源mRNA，這樣從理論上來說若加入任何外源mRNA就可以按新的信息合成蛋白。他們采用了多核苷酸磷酸化酶，僅以尿苷二磷酸為底物，人工合成poly U。當(dāng)他們把人工合成的polyU加入這種無細(xì)胞系統(tǒng)中代替天然的mRNA時(shí)，驚喜地發(fā)現(xiàn)果真合成了單一的多肽，即多聚苯丙氨酸，它的氨基酸殘基全是苯丙氨酸，這一結(jié)果不僅證實(shí)了無細(xì)胞系統(tǒng)的成功，同時(shí)還表明UUU是苯丙氨酸的密碼子。他們用同樣的方法分別加入polyA

14、，polyC和polyG結(jié)果相應(yīng)地獲得了多聚賴氨酸，多聚脯氨酸和多聚甘氨酸。從而順利地破譯了4個(gè)密碼子。</p><p>　?、郯幢壤尤耄卜N核苷混合的多聚物　因當(dāng)時(shí)還未分離RNA聚合酶，無法按設(shè)計(jì)的模板來合成RNA，但除了UUU,CCC,AAA,GGG以外，還必須破譯其他的密碼，Nirenberg又想出了一種新的方法，就是按一定的堿基比例來合成RNA。比如在底物中加5份的UDP和1份的GDP，堿基比為U:G＝

15、5:1，它們能組成的三聯(lián)體不外乎8種：UUU，UUG，UGU，GUU，GGG，GGU，GUG，UGG。U和G將隨機(jī)地加入到三聯(lián)體中，但各個(gè)位點(diǎn)上進(jìn)入U(xiǎn)和G 的概率不同，如UUU:UGG ＝（5´5´5）:（5´1´1）＝25:1；同理UUU:UUG＝5:1，根據(jù)這樣的推測，在無細(xì)胞系統(tǒng)中以這種比例合成的mRNA產(chǎn)生的氨基酸的比例也應(yīng)是相應(yīng)的，這樣可以推測出密碼子的組成。如氨基酸測定結(jié)果：苯丙氨酸

16、（UUU）: 半胱氨酸（UGU）＝ 5:1苯丙氨酸（UUU）: 纈氨酸（GUU）＝ 5:1苯丙氨酸（UUU）: 甘氨酸（GGU）＝ 24:1　苯丙氨酸的密碼子是已知的，由3個(gè)U組成那么半胱氨酸一定是由2個(gè)U，1個(gè)G組成；纈氨酸同樣如此；甘氨酸應(yīng)是由一個(gè)U兩個(gè)G組成。Ochoa,S.及其合作者獲悉Nire</p><p>　?、?tRNA和氨基酸及三聯(lián)體的結(jié)合是特異的；②上述結(jié)合的復(fù)合體大分子是不能通過硝酸

17、纖維濾膜（NC）的微孔，而tRNA-氨基酸的復(fù)合體是可以通過的。Nirenberg采用了一把鑰匙開一把鎖的思路，進(jìn)行破譯密碼。他們首先發(fā)現(xiàn)當(dāng)簡單的特定的核苷酸加入到E.coli的核糖體上時(shí)，它們并不促使蛋白質(zhì)的合成，而引起了特定的tRNA及其攜帶的氨基酸結(jié)合到核糖體上，形成大的復(fù)合體。因此他們每次在無細(xì)胞系統(tǒng)中僅加一種已知順序的三聯(lián)體RNA（如ACA），同時(shí)在氨基酸中只用14C標(biāo)記一種氨基酸（如Ser），若ACA進(jìn)入核糖體后，tRNA

18、上攜帶的不是所標(biāo)記的Ser，那么tRNASer和其攜帶的Ser就不能與核糖體上的ACA特異結(jié)合形成大的復(fù)合體，而從NC上透過，所以通過測定透過NC的tRNA-aa 小復(fù)合體是否帶有標(biāo)記，如帶有標(biāo)記就可以確定輸入的三聯(lián)體ACA不是Ser的密碼子；那么就可重新輸入另外的三聯(lián)體RNA，一直到tRNA所帶有的標(biāo)記的氨基酸不透過NC，說明此三聯(lián)體RNA正好是標(biāo)記氨基酸的密碼子（圖14-3），就這樣Nirenberg小組一舉破譯了全部的密碼。<

19、;/p><p>　　六 .利用重復(fù)共聚物破譯密碼　1965年Khorana以不同的思路和方法也巧妙地破譯了全部的密碼，他發(fā)揮了自己合成RNA的特長，用已知堿基組成二個(gè)、三個(gè)或四個(gè)堿基合成重復(fù)共聚物mRNA，在體外翻譯系統(tǒng)中加入同位素標(biāo)記的氨基酸，然后分析所合成多肽的氨基酸順序，再進(jìn)行比較分析。       Khorana 采用了有機(jī)合成一條短的

20、單鏈DNA重復(fù)順序，然后用DNA 聚合酶 1合成其互補(bǔ)鏈，再用RNA 聚合酶及不同的底物合成兩條重復(fù)的RNA共聚物（圖14－4），作為翻譯的mRNA，加入到體外表達(dá)系統(tǒng)中，根據(jù)合成的肽鏈的相應(yīng)順序來推測各氨基酸的密碼子，如表10-1所示。當(dāng)重復(fù)順序?yàn)椋║C）n 時(shí)，組成的重復(fù)RNA無論怎么閱讀，只可能是UCU-CUC，翻譯的多肽也是由絲氨酸和亮氨酸之間排列的順序，但尚不能確定這兩種氨基酸的相應(yīng)密碼子。當(dāng)重復(fù)順序?yàn)?UUC)n時(shí)，無論怎

21、么閱讀，都只產(chǎn)生三種多聚氨基酸，即poly Ser,poly Leu和poly Phe，和第一次比較，只有一個(gè)密碼子ＵCU相同，但同樣都有Ser和Leu，所以仍不能確定。再看第三行重復(fù)順序（UUAC）n，無論怎么讀法，只會(huì)是四個(gè)密</p><p>　　種方法將所有的遺傳密碼都破譯了。這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)還同時(shí)證實(shí)了三聯(lián)密碼的正確性，以及兼并的存在。由于Nirenberg和Khorana二人在破譯遺傳密碼研究中的卓越貢獻(xiàn)，他們

22、二人共同獲得了1968年的諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。遺傳密碼如表14-2所示。氨基酸縮寫符號如表14-3所示。　七．終止密碼子的確定　1964年Yanofsky在研究E.coli色氨酸合成酶A蛋白時(shí)推測無義密碼子(nonsense codons)（即終止密碼子）的存在。他的推測/是從兩個(gè)不同的角度：一是為trp A編碼的mRNA還編碼了trpB，trpC，trpD和trpE。那么有可能在翻譯時(shí)中途在某個(gè)位點(diǎn)（兩個(gè)肽的連接處）停止

23、，然后再從下一個(gè)新的起點(diǎn)翻譯，這樣使各個(gè)肽可以分開，而不至于產(chǎn)生一條很長的肽鏈。這就意味著終止密碼子(stop codons)的存在。另一個(gè)角度是他發(fā)現(xiàn)E.coli Trp-的突變株是不能合成完整的色氨酸合成酶蛋白，但繼續(xù)對它進(jìn)行誘變可以得到回復(fù)突變?；貜?fù)突變中有兩種，一種是個(gè)別氨基酸發(fā)生了變化，而另一種是完全回復(fù)，沒有任何氨基酸組成的變化，這表明，E.coliTrp-不可能是任何移碼突變的結(jié)果，那么這</p>

24、<p>　　八. 起始密碼子的確定　 在Nirenberg的三聯(lián)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)和Khorana的重復(fù)共聚物的體外翻譯實(shí)驗(yàn)中。合成能從任何堿基起始。但在體內(nèi)卻并非如此，而是需要一個(gè)起始密碼子(initiator codons)。將各種蛋白質(zhì)的氨基酸順序和其編碼順序相比較，起始時(shí)都是AUG密碼子，讀碼也都相同，在原核細(xì)胞中它編碼甲酰甲硫氨酸，在真核細(xì)胞中編碼未經(jīng)修飾的甲硫氨酸。當(dāng)正常的AUG起始密碼子缺失時(shí)，GUG也為起始密