中國被毛孢胞內(nèi)多糖的分離純化與初步結(jié)構(gòu)分析.pdf

1、冬蟲夏草是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材，具有多種藥效，而多糖是其藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。中國被毛孢(Hirsutella sinensis)是冬蟲夏草的無性型，本課題以中國被毛孢菌絲體為原料，采用水提醇沉、有機(jī)溶劑洗滌的方法獲取了粗多糖。
　　 對于粗多糖混雜的淀粉，采用α-淀粉酶或β-淀粉酶和異淀粉酶組合進(jìn)行水解，DNS法檢測酶解釋放的還原糖產(chǎn)生，碘-碘化鉀試劑檢測淀粉殘留，發(fā)現(xiàn)β-淀粉酶和異淀粉酶組合在30℃、pH4.8、料酶比=2

2、5:4(w/w)的條件下酶解6h或α-淀粉酶在57℃、pH5.8、料酶比＝25:1的條件下酶解6h，可以將粗多糖中的淀粉去除干凈。
　　 用DEAE-纖維素陰離子交換層析(2.6×50cm)的方法對去淀粉后的粗多糖進(jìn)行初步的分離，用含有鹽離子的Tris-Hcl緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，梯度分別設(shè)置為0％～15%～50%～100%三個階段、2mL/管進(jìn)行收集，用苯酚-硫酸法檢測糖峰，分別在0%和0～15%的鹽溶液梯度中獲得兩組主要多糖-

3、HST-1和HST-2。HST-1進(jìn)一步用硼酸-硼砂緩沖液梯度洗脫，在不含鹽離子的緩沖液中洗脫得到單一的多糖峰(HSP-A1)和在0～15%鹽溶液硼酸-硼砂緩沖液梯度中洗脫獲得多糖峰(HSP-B1)。
　　 通過GPC研究，分別用0 mol/L、0.005 mol/L、0.01 mol/L、0.02 mol/L等不同濃度的NaAc溶液洗脫，得到在0.005 mol/LNaAc溶液的條件下糖峰的分離度最好；并運(yùn)用GPC2000軟件

4、分析在0.005 mol/LNaAc溶液中洗脫的各個峰的分子量的大小，進(jìn)而確定了下一步凝膠色譜分離所需凝膠條件-Sephadex G-100。
　　 在運(yùn)用SepHadex G-100，洗脫劑為0.005 mol/LNaAc，流速為0.5mL/min，5mL/管進(jìn)行收集，苯酚硫酸法檢測的條件下對HSP-A1和HSP-B1根據(jù)分子量的大小進(jìn)行進(jìn)一步的純化，在運(yùn)用上述條件的基礎(chǔ)上，這部分實(shí)驗(yàn)根據(jù)色譜柱的分辨率分為三個部分：第一部分是

5、運(yùn)用2.8×50cm色譜柱分別對HSP-A1和HSP-B1進(jìn)行兩次重復(fù)上樣純化，從HSP-A1和HSP-B1中分別分離純化得到含糖量較高的糖峰HSN-A3和HSN-B1；第二部分是運(yùn)用1.8×100cm色譜柱對HSN-A3和HSN-B1進(jìn)一步純化，得到HSN-A3和HSN-B1都只產(chǎn)生一個對稱的多糖峰，說明兩個樣品的純度都已經(jīng)很高；第三部分是通過HPLC純化，條件為TSK-GEL，G4000SW凝膠柱(7.5mmx300mm)，柱溫25

6、℃，用0.005 mol/L的NaAc溶液洗脫，流速0.5mL/min，用示差檢測儀進(jìn)行檢測記錄圖譜，并通過HPLC檢測最終樣品的純度，最終獲得兩個單一的、峰形對稱、純度達(dá)95%以上的的純品HSH-3和HSH-4。
　　 運(yùn)用HPLC和化學(xué)衍生化方法聯(lián)用、紅外、Varian400NMR等分析手段對HSH-4進(jìn)行初步的結(jié)構(gòu)分析，根據(jù)GPC2000軟件分析結(jié)果表明，HSH-3的分子量為1.2×104Da，HSH-4的分子量為5.3k