中華被毛孢胞外糖蛋白(HS002-Ⅱ)的分離純化、結(jié)構(gòu)分析及免疫調(diào)節(jié)功能研究.pdf

1、糖蛋白在生物體內(nèi)種類繁多，分布廣泛，具有多方面生物功能。研究表明，糖鏈不僅在維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、防止蛋白質(zhì)水解、增強免疫調(diào)節(jié)等方面作用明顯，還具有細胞識別、抗腫瘤、抗氧化、防衰老等功能，其在功能性食品和新型藥物開發(fā)方面具有廣闊的應(yīng)用前景，而且近年來諸多科研工作者對糖蛋白的藥理作用和保健功能進行了系統(tǒng)深入的研究，取得了一系列重要的成果。
　　 冬蟲夏草(Cordyceps sinensis)性味甘、平入肺經(jīng)，功能益肺腎，止咳嗽，補

2、虛損、益精氣，有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗腫瘤、抗疲勞等多種功效，是一種傳統(tǒng)的名貴滋補中藥材，藥用歷史悠久，被譽為中藥三大寶之一。隨著中藥在世界上的普及和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，蟲草的免疫調(diào)節(jié)活性被進一步證實。雖然蟲草具有復(fù)雜的生物活性，但對其免疫調(diào)節(jié)活性尚缺乏系統(tǒng)性研究。中華被毛孢(Hirsutellasinensis)是從天然蟲草中分離得到的蟲草菌之一，具有與冬蟲夏草相似的生物學(xué)功能，在蟲草天然資源稀缺的情況下，中華被毛孢完全可以作為冬蟲夏草的替代品

3、。本文主要對中華被毛孢胞外糖蛋白HS002-Ⅱ的分離純化、結(jié)構(gòu)分析和免疫調(diào)節(jié)功能等三方面作了系統(tǒng)的分析。
　　 首先從中華被毛孢發(fā)酵的次生代謝產(chǎn)物中，利用DEAE-Sepharose FF陰離子柱層析及Sephacryl S-200凝膠柱層析等分離純化方法，獲得一種均一的糖蛋白組分HS002-Ⅱ，然后通過HPLC、SDS-PAGE方法檢測該糖蛋白組分的純度，初步確定了HS002-Ⅱ的相對分子量為44KDa，其中蛋白質(zhì)的相對含量為

4、42.1％，總糖含量為57，9％，糖醛酸占總糖的15.8％；并通過HPLC、IR等手段對其結(jié)構(gòu)進行了初步分析，確定了該糖蛋白分子含D-甘露糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖、D-木糖和L-阿拉伯糖六種單糖，氨基酸分析確定其含Asp、Thr、Ser、Glu、Gly、Ala等16種氨基酸。
　　 然后系統(tǒng)研究了HS002-Ⅱ的免疫調(diào)節(jié)功能，選擇小鼠巨噬細胞系RAW264.7為細胞模型。通過MTT、Griess reagent

5、、ELISA方法分別檢測該糖蛋白對RAW264.7細胞增殖、釋放NO能力以及細胞因子產(chǎn)生的影響。結(jié)果表明，HS002-Ⅱ在50μg/ml時就能顯著促進RAW264.7細胞的增殖，并能濃度依賴性增強RAW264.7細胞釋放NO的能力和分泌細胞因子TNF-α的能力。進一步采用RT-PCR方法檢測其對巨噬細胞炎癥因子及其信號分子mRNA表達的影響，研究發(fā)現(xiàn)，HS002-Ⅱ能顯著上調(diào)RAW264.7細胞炎癥因子IL-1β、TNF-α和iNOS、

6、NF-κB等基因的轉(zhuǎn)錄水平的基因表達，呈濃度依賴性關(guān)系。然后利用western-blot方法分析其對RAW264.7細胞IκB-α和NF-κB p65蛋白表達的影響，系統(tǒng)探討了HS002-Ⅱ?qū)奘杉毎庖哒{(diào)控作用的可能機制。Western-blot檢測結(jié)果顯示：HS002-Ⅱ能顯著降低RAW264.7細胞胞漿內(nèi)IκB-α和NF-κB p65蛋白的水平，同時顯著增強核內(nèi)NF-κB p65蛋白的水平，表明HS002-Ⅱ能濃度依賴的激活RAW