BYDVs編碼的兩種抑制子及其作用機(jī)制研究.pdf

1、由大麥黃矮病毒(Barleyyellow dwarf viruses,BYDVs)引起的小麥黃矮病在世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生,在我國小麥產(chǎn)區(qū)間隙性大發(fā)生,威脅小麥的生產(chǎn)。為最終達(dá)到防治該病害的目的,各國的科學(xué)家們對大麥黃矮病毒的基因表達(dá)、進(jìn)化、傳播介體與寄主的相互作用等方面開展了深入的基礎(chǔ)研究。篩選鑒定出BYDVs基因組中可能存在的沉默抑制子,可為研究BYDV基因與寄主的互作提供新的證據(jù)。
　　 本實驗室已經(jīng)初步鑒定出BYDV-GAV

2、的ORF6和BYDV-GPV的P0在局部侵染中具有沉默抑制子活性。在已構(gòu)建好的質(zhì)粒載體中篩選出pGD-GPV-P0、pGD-GPV-CP、pGD-GPV-MP、pBin-GAV-CP、pBin-GAV-ORF1和pBin-GAV-ORF6共6個蛋白基因的重組載體,為增加實驗的嚴(yán)謹(jǐn)性,本實驗新構(gòu)建了pGO—GPV-UTR—P0重組載體；其次實驗通過重復(fù)沉默表型觀察證明了GPV的P0和GAV的ORF6在局部侵染中確實具有抑制子活性。隨后采用

3、半定量PCR對浸潤區(qū)GFP的mRNA水平進(jìn)行了檢測,發(fā)現(xiàn)強(qiáng)抑制子蛋白HC-Pro與pBin-mGFP5-ER共同浸潤本生煙后,浸潤區(qū)GFP的mRNA水平明顯比pBin-GAV-ORF6或pGD—GPV-P0與pBin-mGFP5-ER共浸潤葉片后GFP mRNA的積累水平要高,其中接種pGD-GPV-P0與pBin-mGFP5-ER共浸潤葉片后GFP mRNA的積累水平比pBin-GAV-ORF6與pBin-mGFP5-ER的積累水平高

4、。而作為RNA定量標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)參基因EF-1-α的mRNA水平在不同浸潤組合的植株中都是相同的。結(jié)果表明GAV-ORF6抑制子的活性比GPV-P0弱。GFP蛋白的Western blot和GFP mRNA、siRNA的Northern blot分析結(jié)果進(jìn)一步證實了GPV-P0與GAV-ORF6表現(xiàn)出的抑制子活性的差異。雖然GPV-P0、GAV-ORF6的表達(dá)與陽性對照HC-Pro一樣,能夠增加GFP蛋白的表達(dá)量和GFP mRNA的累積量,進(jìn)

5、而增強(qiáng)GFP熒光,但從實驗可以看出GPV-P0這種抑制子的GFP蛋白的表達(dá)量以及GFP mRNA的累積量明顯高于GAV-ORF6。表明GPV-P0是抑制子而GAV-ORF6是弱抑制子。另外,分別將pGD-GPV-P0、pBin-GAV-ORF6與含GFP的植物表達(dá)載體pBin-mGFP5-ER對四葉期轉(zhuǎn)基因煙草16c植株共浸潤,并以HC-Pro作為對照。在侵染16天后對非浸潤葉片進(jìn)行了Northern blot檢測,也證明GPV的P0、

6、GAV的ORF6與PVY的HC-Pro一樣能抑制由GFP正單鏈RNA引起的系統(tǒng)性基因沉默。
　　 此外,為研究BYDV的基因組結(jié)構(gòu)中基因突變(插入、缺失、重復(fù)等)對病毒復(fù)制和表達(dá)策略的影響、驗證病毒的蛋白功能以及確定重要功能結(jié)構(gòu)域,建立BYDVs侵染性cDNA克隆技術(shù)平臺尤為重要。本文以PAV-06KMl4分離物為對象,成功構(gòu)建了pTCK303-06KM14(ubi啟動子控制下)和pGD-06KM14全長基因組侵染性克隆載體,分