兩種防御性多肽的分離純化、結構、功能及作用機制研究.pdf

1、生物防御性物質主要具有防御的功能，如抵抗捕食者或寄主侵襲、微生物感染或保護自己不受到環(huán)境因子的損傷以及在受到傷害時減輕自己的痛苦和盡快恢復到正常狀態(tài)。抗感染和鎮(zhèn)痛是兩類最常見的防御機制，與此相關的物質基礎是抗感染因子和鎮(zhèn)痛因子，如抗菌肽和鎮(zhèn)痛肽。
　　抗菌肽是一種防御性的多肽，在抵御細菌、病毒和真菌侵襲中發(fā)揮著至關重要的作用。防御素是抗菌肽中研究最多最廣的一類陽離子抗菌肽家族。迄今為止，有300多條防御素被發(fā)掘和鑒定出來。防御素廣

2、泛地存在于動物、植物和真菌中，為生物體提供免疫防護。
　　本論文以福鼎蠑螈(Cynopsfudingensis)為研究對象，對其皮膚中的抗微生物多肽進行分離純化和結構功能研究。本研究運用活性追蹤與分離純化相結合的方法。依據(jù)分子量大小，通過Sephadex G-50凝膠過濾層析對福鼎蠑螈皮膚分泌物中的活性物質進行初步分離，隨后運用反相高效液相色譜將Sephadex G-50分離后的活性峰進一步分離純化。從福鼎蠑螈皮膚分泌物中分離純化

3、獲得了一種新抗菌肽CFBD-1，并從福鼎蠑螈cDNA文庫中克隆出編碼CFBD-1成熟肽的完整cDNA序列。CFBD-1前體肽是由17個氨基酸殘基的信號肽，41個氨基酸殘基的成熟肽和3個氨基酸殘基的中間肽構成。成熟肽中有6個半胱氨酸，可形成三對二硫鍵。序列相似度分析發(fā)現(xiàn)CFBD-1中的六個半胱氨酸具有高度保守性，與脊椎動物的β-防御素序列非常類似，是β-防御素家族的新成員。這也是首次從有尾類兩棲動物中發(fā)現(xiàn)防御素抗菌肽。為便于后續(xù)研究，我們

4、構建了CFBD-1原核表達體系，將編碼CFBD-1成熟肽的基因克隆到PET表達載體中，進行轉化誘導表達，獲得具有His-tag的融合蛋白產物。通過親和層析對表達產物進行純化，經(jīng)甲酸化學裂解，SephadexG-50和RP-HPLC分離純化獲得與天然純化多肽活性一致的目的多肽?？咕钚詸z測表明CFBD-1具有廣譜的抑菌效果，對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和白色念球菌都有抑制活性。其中對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌的抑菌效果較強，其

5、最小抑菌濃度(MIC)值為65μg/ml;對革蘭氏陰性菌的抑菌活性較弱，對枯草芽孢桿菌的MIC值為135μg/ml;對大腸桿菌的MIC值為160μg/ml;對真菌白色念球菌的MIC值為200μg/ml。
　　本文中我們還對另外一類防御性多肽（蜘蛛鎮(zhèn)痛肽）進行了研究。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的蜘蛛毒素多肽中，有很大一部分毒素都作用于電壓門控離子通道，其中約有三分之一的毒素都作用于鈉通道。蜘蛛毒素中的半胱氨酸的分布非常保守，多數(shù)蜘蛛毒素半胱氨酸的配對

6、方式為C1-C4，C2-C5和C3-C6，形成典型的抑制劑半胱氨酸結膜體(ICK)結構。泰國金屬藍蜘蛛（Haplopelma lividum）是一種典型的穴居蜘蛛，成年蜘蛛足展長130～150mm，生活在泰國和緬甸的熱帶雨林中，以蟋蟀、蝸牛等昆蟲和小動物為食。泰國金屬藍蜘蛛行動迅速，具有較強毒性，被泰國金屬藍蜘蛛蜇咬后會產生劇烈的疼痛，暗示著該蜘蛛毒液中可能存在神經(jīng)毒素。我們通過研究泰國金屬藍蜘蛛毒腺的轉錄組，篩選得到一種含有4對二硫鍵

7、、由39個氨基酸組成的新型多肽毒素(μ-TRTX-Hl1a)，該多肽毒素形成保守的ICK結構。本研究通過化學合成和氧化還原復性得到μ-TRTX-Hl1a多肽毒素。我們采用膜片鉗技術在大鼠背跟神經(jīng)節(jié)細胞上研究μ-TRTX-Hl1a對離子通道的可能活性，發(fā)現(xiàn)μ-TRTX-Hl1a對電壓門控鉀通道、鈣通道及河豚毒素敏感型的鈉離子通道(TTX-S)均沒有作用，但能夠選擇性的抑制河豚毒素不敏感型鈉離子通道(TTX-R)的電流。μ-TRTX-Hl1

8、a對DRGTTX-R型鈉通道電流的抑制具有濃度依賴性，其半數(shù)有效抑制濃度(IC50)為3.76±0.21μM。鈉離子通道各亞型質粒被轉染到HEK293T細胞中，并檢測μ-TRTX-Hl1a對這些鈉通道亞型的選擇性，發(fā)現(xiàn)該毒素能選擇性抑制Nav1.8電流而對其它亞型沒有作用。μ-TRTX-Hl1a作用于Nav1.8的IC50為2.19±0.18μM。μ-TRTX-Hl1a對Nav1.8離子通道的電壓電流曲線、電導電壓曲線沒有影響，也不改變

9、通道穩(wěn)態(tài)失活。四種鎮(zhèn)痛模型（福爾馬林誘導的舔足模型、輻射熱導致的甩尾模型、冰醋酸誘導的扭體模型、熱板模型）被應用于研究μ-TRTX-Hl1a的鎮(zhèn)痛活性。結果發(fā)現(xiàn)μ-TRTX-Hl1a能夠降低冰醋酸引起的小鼠扭體反應;能顯著延長小鼠在甩尾和熱板模型中對熱痛的反應時間;能顯著地減少福爾馬林在Ⅰ相和Ⅱ相時期誘導的舔足次數(shù)。這表明μ-TRTX-Hl1a能顯著地抑制神經(jīng)痛和炎癥痛，并對熱痛也有抑制作用，其具有廣泛的鎮(zhèn)痛效果。
　　CFBD-