甘藍(lán)轉(zhuǎn)crylIa8和crylBa3雙介Bt基因的研究.pdf

1、結(jié)球甘藍(lán)(Brassica oleracea L.var.capitata L.)是一種重要的十字花科蔬菜，在蔬菜周年供應(yīng)中占有重要地位。近年來，隨著栽培面積的逐年擴(kuò)大，甘藍(lán)的蟲害日趨嚴(yán)重，其中以鱗翅目的小菜蛾(Plutella xylostella)和菜青蟲(Pieris rapae)等為害最為嚴(yán)重。目前生產(chǎn)上害蟲的防治以施用化學(xué)藥劑為主，但化學(xué)農(nóng)藥污染環(huán)境、對(duì)人畜有害，且一些害蟲已對(duì)多種化學(xué)殺蟲劑產(chǎn)生了抗藥性。培育抗蟲品種是防治害蟲

2、最有效的方法，但在甘藍(lán)中抗蟲資源缺乏。利用植物基因工程技術(shù)將外源抗蟲基因轉(zhuǎn)入甘藍(lán)，可為甘藍(lán)育種提供有效的抗蟲種質(zhì)資源。
　　 crylIa8和crylBa3基因是由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所自主分離克隆的。CrylIa8毒蛋白對(duì)小菜蛾和亞洲玉米螟具有很強(qiáng)的殺蟲活性，CrylBa3毒蛋白對(duì)小菜蛾、小猿葉甲和家蠅具有很好的控制作用，并且CrylIa8和CrylBa3與生產(chǎn)上常用的CrylA類毒蛋白之間沒有交互抗性。創(chuàng)制同時(shí)含有cr

3、ylIa8和crylBa3雙價(jià)基因的Bt甘藍(lán)，可以有效地抑制小菜蛾抗性的產(chǎn)生，為小菜蛾的抗性治理提供強(qiáng)有力的支持。
　　 本研究優(yōu)化了甘藍(lán)的再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將crylIa8和crylBa3雙價(jià)基因?qū)敫仕{(lán)高代自交系，主要研究結(jié)果如下：
　　 1.甘藍(lán)再生體系的優(yōu)化
　　 以4個(gè)甘藍(lán)自交系為材料進(jìn)行了再生體系的優(yōu)化：苗齡控制在5 d，選用下胚軸為外植體，激素配比為6-BA2 mg/L+N

4、AA0.1 mg/L的MS培養(yǎng)基，并添加有AgNO33 mg/L時(shí)，可顯著提高不定芽的分化率，最高再生頻率達(dá)到96.87％。
　　 2.甘藍(lán)高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立
　　 以重組質(zhì)粒表達(dá)載體pCSIaN(含crylIa8基因)轉(zhuǎn)化甘藍(lán)，優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)遺傳轉(zhuǎn)化體系：當(dāng)選擇培養(yǎng)基中激素配比為6-BA2 mg/L+NAA0.1 mg/L，并添加有AgNO33 mg/L、Timentin150 mg/L時(shí)能顯著促進(jìn)不定芽的

5、再生，轉(zhuǎn)化頻率最高可達(dá)到10.42％。
　　 3.甘藍(lán)轉(zhuǎn)crylIa8和crylBa3雙價(jià)Bt抗蟲基因植株的獲得
　　 利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將crylIa8和crylBa3雙價(jià)基因?qū)敫仕{(lán)中，共獲得41株卡那霉素抗性植株；分子檢測證明crylIa8和crylBa3雙價(jià)基因已被成功整合到甘藍(lán)基因組中并得到表達(dá)；其中PCR檢測陽性植株33株，Southern blot檢測陽性植株27株，RT-PCR和Western blot