A亞群禽白血病病毒不同分離株的基因組和生物學特性比較.pdf

1、過去十幾年，ALV-J亞群病毒對肉用型雞、蛋用型雞和我國地方品系雞的感染已經給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經濟損失。近兩年，雞白血病/血管瘤病例的顯著上升使該病成為危害我國蛋雞業(yè)的主要疫病之一。病毒分離鑒定表明，血管瘤的發(fā)生不僅由J亞群禽白血病病毒引起，同時也有由A、B亞群禽白血病病毒感染引起。為了調查我國不同品系雞中外源性ALV的感染狀況和病毒的致病特性，本研究分別從進口祖代白羽肉雞、海藍褐蛋雞、中國某地方品系雞采樣接種DF-1細胞，分離到3株外

2、源性ALV，依次為SDAU09C1、SDAU09C3、SDAU09E1。另有本實驗室從另一地方品系雞分離到的外源性ALV，SDAU09E2，對這4個分離株進行了全基因組測序。選擇毒株SDAU09C1和SDAU09C3分別接種白羽肉雞、HN蛋雞、SPF雞的5日齡雞胚，同時以ALV-J亞群病毒NX0101作為參照，比較了三株病毒對不同品種雞的致病性。
　　 1 A亞群禽白血病病毒的分離鑒定
　　 240只直接進口祖代白羽肉雞

3、在潔凈度105的SPF動物房飼養(yǎng)到7日齡時，分別無菌采集抗凝血；從某海藍褐蛋雞場現場采集30份抗凝血，從中國某地方品系雞采集30枚雞蛋，無菌條件下運送到本實驗室。將樣品適當處理后接種DF-1細胞，培養(yǎng)9d或14d后，取細胞培養(yǎng)上清用禽白血病病毒p27抗原檢測試劑盒檢測ALV p27抗原，抗原陽性上清再次感染空白DF-1細胞并擴大培養(yǎng)，再次測得p27抗原陽性樣品即為分離到的外源性ALV。
　　 2四株A亞群禽白血病病毒的序列分析<

4、br>　　 設計7對重疊引物，以病毒感染DF-1細胞基因組DNA為模板分別從4株外源性ALV的前病毒基因組DNA中擴增相應基因片段，PCR擴增產物經克隆、測序后，利用DNAStar軟件將彼此重疊的核苷酸片段拼接，獲得前病毒全基因組序列。并對各基因產物進行序列分析
　　 2.1分離株gp85的序列比較
　　 4個分離株的gp85基因大小不同，編碼氨基酸序列與10株ALV-A亞群參考株的同源性均在87.7％以上，而與ALV

5、-B、C、D、E亞群參考株的同源性僅在76.9％-85.5％之間，與ALV-J亞群參考株的同源性平均僅為38％左右。進化樹分析也顯示4個分離株與ALV-A亞群參考株的同源關系最近。這表明4個分離株均屬于ALV-A亞群病毒。
　　 2.2分離株gag和pol的序列比較
　　 4個分離株的gag pol大小與各亞群參考株一致，編碼的氨基酸序列相對保守，與各亞群參考株的同源性分別在95.4％和97.3％以上。
　　 2

6、.3分離株gp37的序列比較
　　 4個分離株的gp37基因大小不同，編碼氨基酸序列均與內源性病毒ev-6的同源性最高，在92.1％-95.9％之間。
　　 2.4分離株LTR區(qū)的序列比較
　　 4個分離株的LTR大小不同，其中SDAU09C1、SDAU09C3、SDAU09E2三株LTR大小與外源性ALV參考株一致，序列同源性在85-90.7％之間，而與內源性病毒參考株的序列同源性最高只有70％。但SDAU09

7、E1株LTR大小與內源性病毒參考株一致，核苷酸序列與內源性病毒參考株和美國報道的疫苗污染株PDRC-1039、PDRC-3246、PDRC-3249的同源性最高，在91.3-93.5％之間，而與外源性病毒參考株的同源性平均僅為66％。
　　 2.5分離株U3區(qū)的序列比較
　　 在LTR序列內的U3區(qū)，分離株SDAU09C1、SDAU09C3、SDAU09E2與內源性參考株和3個疫苗污染株的同源性平均僅為51％，而與外源性

8、病毒參考株的同源性在82.4-92.5％之間；分離株SDAU09E1與內源性病毒參考株和3個疫苗污染毒株的同源性在82.7％-97.5％之間，而與外源性病毒參考株的同源性小于50％。序列分析表明，SDAU09E1的U3區(qū)主要轉錄調控元件與外源性病毒參考株一致，而其它3個分離株的U3區(qū)主要轉錄調控元件與外源性病毒參考株一致。這表明，SDAU09E1基因組中帶有內源性病毒LTR序列，SDAU09C1、SDAU09C3、SDAU09E2的LT

9、R區(qū)屬于外源性病毒序列。
　　 3四株A亞群禽白血病病毒在細胞上的復制水平比較
　　 將4株分離毒等量接種DF-1細胞，p27抗原ELISA檢測結果顯示，SDAU09E2在DF-1細胞上的復制速度最快，SDAU09C1次之，SDAU09C3低于SDAU09C1，而SDAU09E1復制很慢。病毒滴度檢測結果顯示，相同條件下，SDAU09C1的TCID50最高，SDAU09E2次之，SDAU09C3低于SDAU09E2，而S

10、DAU09E1的TCID50值顯著低于其它3株病毒（最小相差100倍）。4株分離毒在DF-1細胞上復制水平的差異可能與它們U3區(qū)啟動子活性密切相關。
　　 4不同毒株的致病性比較
　　 4.1 SDAU09E1和SDAU09C1的感染性比較
　　 用SDAU09E1和SDAU09C1等量腹腔注射1日齡SPF雞的實驗結果顯示，SDAU09C1攻毒雞產生了免疫耐受，持續(xù)泄殖腔p27抗原陽性，沒有產生抗體反應，且橫向傳

11、播能力較強。SDAU09E1攻毒雞僅表現一過性病毒血癥，抗體反應很慢，沒有發(fā)生橫向感染。這表明帶有內源性LTR特別是U3序列的病毒SDAU09E1對SPF雞的感染能力顯著低于病毒SDAU09C1。
　　 4.2 SDAU09C1和SDAU09C3對白羽肉雞、蛋雞、SPF雞的不同類型致病性比較
　　 選擇分離株SDAU09C1和SDAU09C3分別接種白羽肉雞、HN蛋雞、SPF雞的5日齡雞胚，同時以本實驗室分離的ALV-J

12、亞群毒株NX0101作為對照，比較三株病毒對不同品種雞的致病性。
　　 4.2.1三株ALV對不同品種雞的致腫瘤性
　　 對自然死亡雞的解剖發(fā)現，在20w-27w內，SDAU09C1和SDAU09C感染的白羽肉雞分別出現1例腫瘤病例，NX0101感染的白羽肉雞分別出現2例腫瘤病例；SDAU09C1感染的HN蛋雞出現1例腫瘤病例，NX0101和SDAU09C3感染的HN蛋雞均沒有出現腫瘤；SDAU09C1感染的SPF雞有4

13、只表現為骨硬化，1只表現為腎臟腫大和肝萎縮，SDAU09C3感染的SPF雞有1只表現為骨硬化，NX0101感染的SPF雞出現3只腫瘤病例。而且腫瘤類型表現比較復雜。3株ALV感染不同品種雞腫瘤類型的多樣化及致腫瘤數的差異可能與病毒特性、宿主的遺傳背景及宿主的個體差異有關。
　　 4.2.2三株ALV對不同品種雞免疫水平的影響
　　 三株ALV感染3個品種雞在第6w時測得脾臟與體重比、胸腺與體重比、法氏囊與體重比在統(tǒng)計學水

14、平上沒有發(fā)生顯著變化（P>0.05），而三株ALV感染的不同品種雞針對NDV、AIV-H9、AIV-H5疫苗免疫產生了不同程度的免疫抑制。
　　 4.2.3三株ALV對不同品種雞的感染性比較
　　 病毒血癥、泄殖腔p27抗原和血清抗體的檢測結果顯示，NX0101雞胚接種在白羽肉雞產生的感染程度比在HN蛋雞嚴重，與SPF雞水平相當，但在白羽肉雞中的橫向傳播水平較高，在HN蛋雞和SPF雞中的橫向傳播能力較弱。SDAU09C1

15、雞胚接種在部分SPF雞產生了免疫耐受，而且橫向傳播水平較高，在白羽肉雞僅誘導產生-過性病毒血癥，橫向傳播水平較低，在HN蛋雞引起的感染程度介于白羽肉雞和SPF雞之間，但可以產生較高水平的橫向傳播。SDAU09C3接種SPF雞胚引起耐受性病毒血癥，橫向傳播水平較高，接種HN蛋雞雞胚產生的感染程度和橫向傳播水平低于SPF雞，接種白羽肉雞雞胚產生的感染和橫向傳播能力都很低。這表明NX0101對白羽肉雞和SPF雞的感染性最高，SDAU09C1和

16、SDAU09C3對SPF雞和HN蛋雞的感染程度高于對白羽肉雞。而且在SPF雞，三株病毒產生的感染程度為SDAU09C3>SDAU09C1>NX0101；在HN蛋雞，為SDAU09C1>SDAU09C3>NX0101；在白羽肉雞，為NX0101>SDAU09C1>SDAU09C3。
　　 4.2.4三株ALV對不同品種雞的其它致病類型比較
　　 三株ALV感染3個品種雞在生長發(fā)育上表現出不同程度的抑制，病毒NX0101感染

17、白羽肉雞的體重水平最低，病毒SDAU09C3感染HN蛋雞的體重水平最低，病毒SDAU09C1和NX0101感染SPF雞體重水平低于病毒SDAU09C3感染的SPF雞。血常規(guī)分析顯示，三株ALV感染不同品種雞的血液白細胞數和淋巴細胞數在1w-15w沒有發(fā)生顯著變化（P>0.05）。但在第21w時，SDAU09C1和SDAU09C3感染白羽肉雞的白細胞數和淋巴細胞數顯著高于對照組（P<0.05）；SDAU09C3和NX0101感染SPF雞的