福建河田雞群重組禽白血病病毒FJ15HT0株分離鑒定及其生物學(xué)特性研究.pdf

1、禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科（Retroviride），甲型反轉(zhuǎn)錄病毒屬（Alpharetrovirus），根據(jù)病毒囊膜糖蛋白抗原性、病毒干擾試驗(yàn)、宿主范圍及基因組分子生物學(xué)特性，將ALV劃分為10個(gè)亞群，分別命名為A、B、C、D、E-I以及J亞群。其中A、B、C、D和J亞群為外源性ALV，E-I亞群為內(nèi)源性ALV。ALVs可導(dǎo)致雞群生產(chǎn)性能下降、免疫抑制和多種腫瘤表現(xiàn)，嚴(yán)重影響?zhàn)B禽業(yè)

2、健康發(fā)展，因此是世界各國(guó)重點(diǎn)防控的病原體之一。近些年來(lái)，我國(guó)的ALV防控形勢(shì)嚴(yán)峻，肉雞、蛋雞和地方雞群中主要流行毒株多為J亞群，A/B亞群研究相對(duì)較少，然而其在雞群中的感染率和病毒變異表現(xiàn)出增強(qiáng)趨勢(shì)。為了研究福建省著名地方品系河田雞中外源性ALV的感染狀況和致病性，本研究對(duì)河田雞群中疑似ALV感染病例進(jìn)行樣品采集和細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行病毒分離，通過間接免疫熒光試驗(yàn)、鑒定PCR對(duì)該分離株進(jìn)行初步鑒定，通過分段擴(kuò)增PCR進(jìn)行全基因組測(cè)定及分析，從而

3、確定該病毒的分類地位；通過接種6胚齡白來(lái)航雞胚模擬垂直傳播，并設(shè)立1日齡和42日齡同居感染組，以此闡明該毒株不同傳播方式對(duì)雞群生長(zhǎng)性能、免疫性能、感染狀態(tài)及腫瘤表型的影響。主要試驗(yàn)內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　1.ALV-B的分離鑒定
　　通過采集疑似ALV感染河田雞的肛腸棉拭子和靜脈血，通過ELISA檢測(cè)肛腸棉拭子樣品中的ALV群特異性抗原p27，鑒定為陽(yáng)性者，對(duì)其相應(yīng)的靜脈血樣品進(jìn)行處理后接種單層DF-1細(xì)胞以分離病毒，設(shè)立空白

4、細(xì)胞對(duì)照組。
　　盲傳3代后，細(xì)胞培養(yǎng)上清p27 ELISA檢測(cè)表現(xiàn)為陽(yáng)性的DF-1細(xì)胞進(jìn)行固定，分別以p27特異性單克隆抗體（McAb）和J亞群特異性McAb作為一抗，以FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)（IFA），結(jié)果顯示，該毒株表達(dá)p27抗原，不具備J亞群特異性gp85蛋白，為一株非J亞群的外源性ALV。提取感染細(xì)胞DNA作為模板進(jìn)行g(shù)p85特異性PCR，并進(jìn)行序列測(cè)定及比對(duì)分析。結(jié)果顯示該毒株具有B亞群

5、特異性gp85基因序列，并將該毒株命名為FJ15HT0。
　　2.FJ15HT0的全序列測(cè)定及分析
　　為進(jìn)一步了解該毒株的基因組特性，根據(jù)參考ALV毒株基因序列設(shè)計(jì)8對(duì)能夠覆蓋ALV前病毒DNA全序列的相互重疊的引物，經(jīng)分段PCR擴(kuò)增出目的條帶，并進(jìn)行克隆和酶切鑒定，選取3個(gè)陽(yáng)性克隆送至生物公司進(jìn)行測(cè)序，通過軟件拼接得到該分離株的前病毒DNA全基因組序列。該毒株前病毒DNA全長(zhǎng)為7785 bp，基因組結(jié)構(gòu)為5'-LTR-g

6、ag-pol-env-LTR-3'，符合典型的復(fù)制完全型反轉(zhuǎn)錄病毒的基因組結(jié)構(gòu)模式，不攜帶原癌基因（Oncogene）。通過與各亞群經(jīng)典ALV參考毒株序列進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)FJ15HT0株為一株重組毒，具體分析如下：
　　（1）gag和pol基因序列分析
　　序列分析可知該毒株的gag與pol基因序列保守，與其他參考毒株gag基因編碼的氨基酸序列同源性在96％以上，pol基因編碼的氨基酸序列同源性在97%以上。
　　

7、（2）env基因序列分析
　　env基因編碼gp85和gp37基因，其中g(shù)p85的推導(dǎo)氨基酸序列與B亞群參考株同源性在91%以上，與其余亞群參考株同源性均在90%以下，其中與J亞群參考株同源性僅為48.1%；而其gp37推導(dǎo)氨基酸序列與E亞群參考株ev-1同源性最高為90.6%，與J亞群參考毒株HPRS103同源性最低僅為55.6%，與A、B、C、D亞群平均同源性為88.7%。
　　（3）LTR序列分析及調(diào)控元件分析

8、　　該分離株LTR序列與其他參考株的核苷酸同源性在71-90.5%之間，其中與J亞群參考株HPRS103同源性最高為90.5%；該毒株的3'端U3區(qū)含有與ALV-J HPRS103相同的順式調(diào)控元件，存在2個(gè)Y Box、2個(gè)CArG，符合復(fù)制能力強(qiáng)的外源性ALV的典型特征。
　?。?）UTR序列分析
　　該分離株5'UTR與其他亞群參考株5'UTR核苷酸序列同源性在83-94.5%之間，與 C亞群 Prague C毒株同源性

9、最高為94.5%；FJ15HT0毒株的3'UTR序列與參考毒株該區(qū)域序列同源性為60.3-82.4%，與A亞群參考株RSA同源性最高為82.4%。
　　根據(jù)以上全序列分析，可知該毒株為具有ALV-B特異性gp85基因序列、ALV-E gp37序列、ALV-J LTR序列的重組ALV毒株。
　　3.FJ15HT0分離株生物學(xué)特性
　　48只SPF雞胚隨機(jī)分為4組，每組12只：A組，6胚齡接種DMEM；B組，6胚齡卵黃囊接

10、種病毒；C組，6胚齡接種DMEM，雛雞1日齡（d）與接毒組同居飼養(yǎng)；D組，6胚齡接種DMEM，42日齡時(shí)與接毒組同居飼養(yǎng)；各組隔離飼養(yǎng)直至11周齡（w）。
　　（1）感染方式對(duì)排毒情況的影響
　　雛雞1d、1w、2w、3w、4w、5w、6w、7w、8w、9w、10 w、11 w時(shí)采集胎糞或泄殖腔棉拭子，采用ALV抗原檢測(cè)試劑盒檢測(cè)p27抗原。接毒組從1 d到11 w均可檢測(cè)出p27抗原陽(yáng)性，1 d同居組與42 d同居組檢測(cè)p

11、27抗原均為陰性，說(shuō)明通過垂直傳播途徑感染能夠使雞群持續(xù)排毒，早期和晚期水平傳播感染并不能使雞群排毒。
　?。?）感染方式對(duì)病毒抗體消長(zhǎng)規(guī)律的影響
　　雛雞出殼后，分別在2w、3w、5w、7w、9w、11w采集全部雞只抗凝血，分離血漿進(jìn)行ALV-A/B抗體檢測(cè)，結(jié)果顯示：空白對(duì)照組均未檢測(cè)到ALV-A/B抗體；接毒組從孵化到11 w均表現(xiàn)為ALV-A/B抗體陰性；1 d同居組在與接毒組同居飼養(yǎng)3 w、5 w、11 w時(shí)各出現(xiàn)

12、1只雞ALV-A/B抗體陽(yáng)性，陽(yáng)性率為分別為9.1%、11.1%和14.3%，在7 w時(shí)出現(xiàn)2只雞檢測(cè)到ALV-A/B抗體，陽(yáng)性率為25%；42 d同居組在與接毒組同居飼養(yǎng)3周后檢測(cè)到2只雞ALV-A/B抗體陽(yáng)性，陽(yáng)性率為28.6%，11 w出現(xiàn)3只雞檢測(cè)到ALV-A/B抗體陽(yáng)性，陽(yáng)性率為42.9%?？梢?，接毒組雞只均未檢測(cè)到ALV-A/B抗體符合胚內(nèi)感染導(dǎo)致免疫耐受的特性；同居感染雞只最早與病毒接觸后
　　3周可出現(xiàn)血清抗體。<

13、br>　?。?）感染方式對(duì)病毒血癥的影響
　　在2w、3w、5w、7w、9w、11w采集雞抗凝血，分離血漿，接種DF-1細(xì)胞，7 d后取上清以ELISA檢測(cè)p27抗原。接毒組從1d到11w可檢測(cè)到病毒血癥；1d同居組在2w、3w、5w部分雞只檢測(cè)到病毒血癥，42 d同居組均未檢測(cè)到病毒血癥，表明雞胚接種和早期同居感染能夠讓雞群產(chǎn)生病毒血癥，而晚期同居感染未能誘發(fā)病毒血癥。
　?。?）感染方式對(duì)生長(zhǎng)性能的影響
　　在雛雞

14、1-11 w期間，每個(gè)周齡對(duì)各組雞只進(jìn)行稱重，所測(cè)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示該毒株胚內(nèi)感染對(duì)白來(lái)航雞具有顯著生長(zhǎng)抑制作用，11 w時(shí)接毒組均重僅為空白組均重的61.8%，接毒組與空白組在2-11 w差異顯著（P＜0.05）；該毒株對(duì)早期同居飼養(yǎng)的雞只體重具有抑制作用，11 w時(shí)1日齡同居組均重僅為空白組的67.8%，3-11 w期間1 d同居組雞體重較空白組顯著降低（P＜0.05）；該毒株對(duì)晚期同居飼養(yǎng)的雞只生長(zhǎng)性能影響不顯著，42 d同居

15、組雞體重較空白組差異不顯著（P＞0.05）；1-11 w期間接毒組雞體重較1 d同居組差異不顯著（P＜0.05）；6-11 w期間接毒組雞體重較42 d同居組顯著降低（ P＜0.05）；在2 w、3 w、4 w、6-11 w期間1 d同居組雞體重較42 d同居組顯著降低（P＜0.05）。
　?。?）感染方式對(duì)免疫器官指數(shù)的影響
　　在11w剖殺全部雞只，取其胸腺、脾臟、法氏囊進(jìn)行稱重，計(jì)算其免疫器官指數(shù)。結(jié)果顯示：接毒組脾臟

16、、胸腺、法氏囊指數(shù)較空白組差異不顯著（P＞0.05）；1 d同居組雞的脾臟指數(shù)較空白組顯著降低（P＜0.05），胸腺、法氏囊指數(shù)較空白組差異不顯著（P＞0.05）；42 d同居組免疫器官指數(shù)較空白組差異均不顯著（P＜0.05）。
　?。?）對(duì)NDV、AIV-H5的抗體水平抑制作用
　　至雛雞7 d，全部雛雞經(jīng)點(diǎn)眼滴鼻的方式接種雞新城疫LaSota株活疫苗，全部雞只頸部皮下免疫重組禽流感病毒H5亞型二價(jià)滅活疫苗0.2 mL，在

17、21 d同法進(jìn)行二次免疫。
　　在2w、3w、5w、7w、9w、11w采集雞抗凝血，分離血漿，采用血凝抑制試驗(yàn)（HI）檢測(cè)新城疫病毒（NDV）抗體滴度。結(jié)果顯示：該毒株胚內(nèi)感染對(duì)雞只的NDV活疫苗免疫應(yīng)答具有抑制作用，在3 w、9 w、11 w接毒組NDV抗體產(chǎn)生水平較空白組顯著降低（ P＜0.05）；1 d同居組在9 w、11 w時(shí)NDV抗體產(chǎn)生水平較空白組差異顯著降低（ P＜0.05），42 d同居組在9 w、11 w時(shí)NDV

18、抗體產(chǎn)生水平較空白組差異顯著降低（P＜0.05）。據(jù)此可知，該毒株對(duì)白來(lái)航雞雞胚接毒及同居飼養(yǎng)對(duì)NDV疫苗抗體的產(chǎn)生具有一定的抑制作用。
　　雛雞不同周齡采集抗凝血，分離血漿進(jìn)行HI試驗(yàn)，檢測(cè)抗AIV-H5滅活苗抗體滴度，結(jié)果顯示：接毒組、1 d同居組、42 d同居組與空白組比較差異均不顯著（P＞0.05）。
　?。?）誘發(fā)腫瘤表型
　　11w時(shí)剖殺所有試驗(yàn)動(dòng)物，采集其心臟、肝臟、脾臟、腎臟、法氏囊、胸腺組織經(jīng)過甲醛固

19、定后制備石蠟切片，經(jīng)過HE染色后顯微鏡觀察其病理變化，結(jié)果顯示：胚內(nèi)接種FJ15HT0毒株導(dǎo)致感染雞脾臟和肝臟中呈現(xiàn)腫瘤病灶，病灶表現(xiàn)為實(shí)體瘤，瘤內(nèi)聚集深染的未成熟的淋巴細(xì)胞，瘤體界限較為清晰，大小不一，判定感染雞只發(fā)生了淋巴細(xì)胞瘤?？瞻讓?duì)照組和同居感染組試驗(yàn)動(dòng)物組織中均未發(fā)現(xiàn)腫瘤存在。證實(shí)該毒株胚內(nèi)感染對(duì)SPF雞具有較強(qiáng)的致瘤能力。
　　本研究從河田雞中分離到一株外源性ALV，對(duì)其進(jìn)行全基因組測(cè)定與序列分析，確定該毒株為一株自然