耐寒相關基因轉化華南木薯品種研究.pdf

1、木薯(Manihot esculenta Crantz)是世界熱帶亞熱帶地區(qū)重要的糧食與經濟作物之一。傳統(tǒng)的育種方式為選育木薯良種方面作出了重要的貢獻,但是由于木薯是高度雜合的特質加上種質資源的限制及常規(guī)育種方法的局限性,讓木薯進一步的遺傳改良陷入困境。隨著分子生物學研究的深入,基因的鑒定、克隆、重組技術及轉基因技術的日趨成熟,利用基因工程手段進行木薯遺傳改良,增強木薯抗病蟲和耐逆境能力,提高木薯塊根產量,改善木薯淀粉品質及降低有害物質

2、的含量等,已成為木薯育種的一種有效手段。木薯是一種抗逆性比較強的熱帶、亞熱帶作物,但是地域性的適應特性決定其不能忍受低溫的環(huán)境。通過農桿菌法將抵抗逆境相關的基因引入木薯基因組,可以改善木薯的耐寒品質,使其能在較低溫度的環(huán)境中種植,為木薯北移或特異性區(qū)域種植提供品種保障。
　　 本研究以四個木薯優(yōu)良品種華南5號、6號、7號和8號為實驗材料,進行了以下方面的研究:建立了木薯無菌苗繁殖系統(tǒng);木薯體胚的循環(huán)誘導及體胚子葉再生培養(yǎng)條件研究

3、;消毒劑種類、取材時間及取材地點對木薯外植體消毒效果的影響;6-BA對木薯單芽莖段生長的影響;2,4-D和picloram對不同品種木薯體胚發(fā)生能力的影響;體胚成熟時間對子葉植株再生能力的影響;建立了木薯遺傳轉化受體體系;利用建立的木薯遺傳轉化受體系統(tǒng),采用農桿菌(GV3101)介導對木薯體胚子葉進行遺傳轉化,并對共培養(yǎng)時間對遺傳轉化的影響進行研究;用六個植物表達載體對華南木薯優(yōu)良品種華南5號、6號和8號進行轉化,并獲得再生植株共127

4、9株;對再生植株進行抗性檢測及分子檢測;將轉基因植株煉苗移栽至花盆,成功移栽了600多株苗;對轉基因株系進行組培苗和盆栽苗的低溫處理鑒定其低溫脅迫下的適應能力。主要研究結果如下:
　　 1.取材時間地點及消毒劑對木薯啟動培養(yǎng)消毒影響效果不同,研究表明最佳的消毒方式是:取室內培養(yǎng)的木薯外植體材料,經過洗衣粉水浸泡10min,流水沖洗20min,75％酒精浸泡40s,0.1％HgCl2消毒10min,可達到很好的消毒效果,無菌率在9

5、0％以上。
　　 2.6-BA對抑制木薯頂端優(yōu)勢很明顯,濃度越高抑制越強。它不僅抑制木薯芽的徑向生長,也抑制根的徑向生長。但是適宜的濃度可以促使木薯腋芽萌發(fā)產生叢生芽。對于需要木薯植株快速成苗的情況,以不添加任何激素的MS基本培養(yǎng)基培養(yǎng)效果最好。
　　 3.兩種激素2,4-D(8mg/l)和picloram(12mg/l)對四個木薯初級體胚的形成都有很強的促進作用,其效果相當。初級體胚繼代后除華南7號木薯外都能達到100

6、％的產胚率,而華南7號得木薯初級體胚卻在繼代后衰敗。
　　 4.CaCl2在木薯初級體胚的誘導過程中作用不明顯,而繼代后30d就有了明顯的結果,實驗設計范圍內的高濃度CaCl2對繼代后的體胚形成有促進作用。15mmol/l的CaCl2可以保持體胚100d的活力。
　　 5.成熟培養(yǎng)不同時間對木薯體胚子葉器官發(fā)生很有影響。成熟10～15d的木薯體胚子葉器官發(fā)生率比較好,誘導頻率在70％以上。
　　 6.華南木薯良好

7、的遺傳轉化體系:將培養(yǎng)10～15d的子葉胚盡量切小,用OD600在0.9～1.1之間的工程菌液進行侵染45min,然后共培養(yǎng)3d后清洗去菌,轉到含500 mg/l羧芐青霉素和10mg/l潮霉素的低選擇壓器官發(fā)生培養(yǎng)基上進行初篩及高抗菌素脫菌1周后,再進行500mg/l羧芐青霉素和20mg/l潮霉素正常選擇壓器官發(fā)生培養(yǎng)基篩選2～3周。經過兩次篩選的組織已有器官發(fā)生,選擇有芽器官的組織轉到莖器官伸長培養(yǎng)基上培養(yǎng)直到芽長至1～2cm。切下芽

8、接種到無激素培養(yǎng)基上成苗培養(yǎng)。適量擴繁轉化苗后,切取1～2cm頂端部分莖段進行10mg/l潮霉素選擇壓生根篩選。對于選擇壓下有根形成的轉化株系再進行后續(xù)的分子檢測。該體系適合華南5號,6號,8號;但轉化效率略有差別。以華南8號得轉化效率最好,華南5號和華南6號效果相當。
　　 7.通過PCR檢測的方法對篩選壓上形成的轉化植株進行了檢測,共鑒定出:pVKH-35S-AtGolS2-pA轉基因木薯198個PCR陽性株系,其中PCR為

9、陽性且在篩選壓上生根的株系有81個。pVKH-35S-AtGolS2-ipt-pA轉基因木薯203個陽性株系,其中PCR為陽性且在篩選壓上生根的株系有79個。pVKH-35S-CBF3-pA轉基因木薯167個陽性株系,其中PCR為陽性且在篩選壓上生根的株系有50個。pCA-CP-CBF3-pA轉基因木薯123個陽性株系,其中PCR為陽性且在篩選壓上生根的株系有78個。pVKH-35S-AtGolS3-pA轉基因木薯309個陽性株系,其中

10、PCR為陽性且在篩選壓上生根的株系有93個。pCA-CP-CBF3-35S-AtGolS3-pA轉基因木薯104個陽性株系,其中PCR為陽性且在篩選壓上生根的株系有25個。
　　 8.通過RT-PCR對PCR為陽性且篩選壓上可以生根的株系進行對應的檢測。結果得到pVKH-35S-AtGolS2-pA轉基因木薯65個陽性株系;pVKH-35S-AtGolS2-ipt-pA轉基因陽性株系48個;pVKH-35S-CBF3-pA轉基因

11、陽性株系39個;pCA-CP-CBF3-pA轉基因57個陽性株系;pVKH-35S-AtGolS3-pA轉基因木薯64個陽性株系;pCA-CP-CBF3-35S-AtGolS3-pA轉基因木薯20個陽性株系。
　　 9.對部分RT-PCR結果為陽性的植株進行了PCR-southern雜交結果也為陽性。這一系列的檢測進一步證明了抗寒基因在實驗的3個華南木薯品種中得以整合并表達。轉基因植株的基因組酶切Southern雜交正在探索中。

12、
　　 10.本文通過對木薯組培苗移栽基質的選擇、移栽季節(jié)的選擇及苗的狀態(tài)方面的研究,表明適合木薯移栽的經濟方法是:采用海南紅土+細沙(+腐殖土)=2:2(:1)作為栽培基質,選擇在每年的2～3月份,將培養(yǎng)1月的組培苗進行水培閉口3d,開口4d煉苗后,移栽,移栽后澆足定根水。通過此法,本研究成功移栽600多株木薯轉基因苗。本研究還發(fā)現(xiàn),對越冬木薯組培移栽苗進行春季修剪,留下基本10cm左右主莖,可以促進木薯苗的快速生長。

13、　　 11.本研究對轉基因木薯組培苗及盆栽苗進行了低溫處理檢測。通過對轉基因木薯組培苗和非轉基因組培苗進行低溫脅迫觀察表型變化,發(fā)現(xiàn)在相同的處理條件下,非轉基因植株因不能適應低溫的環(huán)境,完全枯死,而部分木薯轉AtGolS2、AtGolS2-ipt、CBF3基因株系卻表現(xiàn)出了很強的低溫耐受性,植株項部生長組織并沒有被低溫完全迫害,恢復室溫后又能繼續(xù)生長。通過對盆栽苗進行4℃低溫處理及生理指標的檢測發(fā)現(xiàn),部分轉AtGolS2、AtGolS