中國(guó)野生葡萄芪合酶基因轉(zhuǎn)化無核葡萄品種的研究.pdf

1、本研究以愛莫無核葉片、葉柄和無核白花藥、子房等外植體為試材，通過器官發(fā)生途徑和胚狀體發(fā)生途徑建立了葡萄再生體系；并將攜帶有中國(guó)野生葡萄芪合酶基因的植物表達(dá)載體pWR306，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)愛莫無核葉片葉柄、長(zhǎng)穗無核白葉柄、無核白胚狀體及胚性愈傷進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，研究了潮霉素(Hyg)篩選濃度、頭孢霉素(Cef)脫菌濃度、農(nóng)桿菌侵染濃度、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間等遺傳轉(zhuǎn)化因素；并通過Hyg篩選、PCR檢測(cè)、Southern雜交等方法對(duì)外源基因的整合進(jìn)行了

2、檢測(cè)。取得的主要結(jié)果如下： 1.葡萄再生體系的建立 (1)器官發(fā)生途徑再生體系的建立 以愛莫無核葡萄的葉片、葉柄為材料，通過研究不同激素濃度組合對(duì)外植體愈傷誘導(dǎo)及不定芽分化的影響，建立了葡萄器官發(fā)生途徑的再生體系。葉片再生適宜培養(yǎng)基為MS+TDZ2.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1，再生率為21.57％；葉柄再生適宜培養(yǎng)基為MS+TDZ1.0mg·L-1，再生率為2.08％；不定芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基為MS+TDZ

3、0.25mg·L-1+NAA0.01mg·L-1；生根成苗培養(yǎng)基為1/2MS+IBA0.1mg·L-1。 (2)胚狀體發(fā)生途徑的建立 以無核白葡萄花藥、子房為材料，研究葡萄胚狀體發(fā)生途徑的再生。結(jié)果表明：無核白的花藥和子房胚性愈傷組織誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基分別為MS+BA4.0mg·L-1+2,4-D0.5mg·L-1+3％蔗糖和MS+BA4.0mg·L-1+2,4-D1.0mg·L-1+蔗糖30g·L-1；胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基為M

4、S+BA4.0mg·L-1+蔗糖30g·L-1；在無激素的MS培養(yǎng)基中胚狀體很快萌發(fā)；成苗培養(yǎng)基為WPM+蔗糖15g·L-1。 2.遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化 (1)Hyg選擇壓的確定 以愛莫無核葉片和擴(kuò)繁單芽莖段為試材，研究Hyg對(duì)葡萄葉片不定芽再生及植株生長(zhǎng)的影響，確定了Hyg篩選濃度和篩選方式。葡萄遺傳轉(zhuǎn)化后進(jìn)行延遲篩選，并逐步增加潮霉素的濃度，起始濃度為3mg·L-1再逐步增加至12mg·L-1可減少對(duì)再生的抑制

5、。 (2)脫菌素Cef濃度的確定 以愛莫無核葉片為試材，研究Cef對(duì)不定芽再生的影響，確定了Cef的最佳脫菌濃度為400mg·L-1。 (3)農(nóng)桿菌侵染濃度的確定 分別以葉片、葉柄、胚狀體和胚性愈傷為試材，研究在不同濃度農(nóng)桿菌下脫菌的難易，確定了不同外植體侵染時(shí)農(nóng)桿菌的最佳侵染濃度。葉片、葉柄適宜的OD600值為 0.3～0.5；胚狀體為0.3～0.4；胚性愈傷為0.3。本試驗(yàn)選取OD600=0.

6、3進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。 (4)預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的確定 以愛莫無核葡萄葉片為試材，研究葉片預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的影響，確定葉片遺傳轉(zhuǎn)化的最佳預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為9天。 3.外源基因的檢測(cè) (1)潮霉素篩選 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化愛莫無核葉片、葉柄和長(zhǎng)穗無核白葉柄，經(jīng)潮霉素篩選后分別獲得17和82株抗性芽，愛莫無核抗性芽伸長(zhǎng)緩慢，2個(gè)抗性芽成苗；長(zhǎng)穗無核白共有38個(gè)抗性芽生根成苗，成苗率為46.34％。 轉(zhuǎn)化后的無核白

7、小植株經(jīng)潮霉素篩選后，共獲得49個(gè)抗性株系。 (2)PCR檢測(cè)外源STS基因的整合 分別對(duì)20個(gè)長(zhǎng)穗無核白的抗性株系及選取的15個(gè)無核白抗性株系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果有11個(gè)長(zhǎng)穗無核白和7個(gè)無核白抗性株系擴(kuò)增出約1288bp的特異條帶，而非轉(zhuǎn)基因的葡萄對(duì)照無特異性條帶出現(xiàn)。初步表明外源基因已經(jīng)整合進(jìn)植株的基因組中。 (3)Southern雜交 分別對(duì)PCR檢測(cè)為陽性的5個(gè)長(zhǎng)穗無核白株系進(jìn)行Southern雜