中國(guó)葡萄屬野生種芪合成酶基因載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化煙草研究.pdf

1、　　白藜蘆醇作為葡萄屬植物的抗逆代謝物質(zhì)—植保素(phytoalexin)，是葡萄屬植物對(duì)病原菌或其它各種誘發(fā)因子脅迫下迅速在細(xì)胞中累積的一種次生代謝物質(zhì)，它在細(xì)胞中的積累可以提高植物的抗病性。本研究是在獲得中國(guó)葡萄屬野生種華東葡萄白河-35-1芪合成酶基因(STS)的基礎(chǔ)上構(gòu)建中國(guó)葡萄屬野生種芪合成酶基因植物表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101中，然后通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將STS基因?qū)霟煵?，借以初步探討芪合成酶基因在煙草中的轉(zhuǎn)化和

2、表達(dá)情況，為其今后在葡萄屬植物上的應(yīng)用提供依據(jù)。主要研究結(jié)果如下： 1.中國(guó)葡萄屬野生種芪合成酶基因的克隆、序列測(cè)定 根據(jù)本課題組獲得的中國(guó)葡萄屬野生種華東葡萄白河-35-1芪合成基因cDNA全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)特異引物，并進(jìn)行了修飾和改造，即增加了與植物表達(dá)載體pWR306相匹配的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。 2.植物中間表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定　　利用DNA重組技術(shù)，將質(zhì)粒pSB166中包含ED35s-Ω-MCS-UTT-

3、TNOS的一段核苷酸序列定向克隆到質(zhì)粒pCAMBIA1303上，經(jīng)酶切、電泳鑒定表明，已成功構(gòu)建了植物中間表達(dá)載體pWR306。 3.中國(guó)葡萄屬野生種芪合成酶基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建　　雙酶切重組質(zhì)粒pGEM-T-STS及表達(dá)載體pWR306，將STS基因片段與線性表達(dá)載體pWR306進(jìn)行定向連接，構(gòu)建了芪合成酶基因的植物表達(dá)載體pWR-STS,通過(guò)酶切、電泳鑒定，STS基因已成功構(gòu)建到植物表達(dá)質(zhì)粒pWR306中，將此克隆命名為

4、pWR-STS。 4.重組質(zhì)粒pWR-STS導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌GV3101　　采用改進(jìn)凍融法，將重組質(zhì)粒pWR-STS導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101中，在卡那霉素和慶大霉素的平板上篩選陽(yáng)性克隆，至有單菌落出現(xiàn)，進(jìn)行菌落直接PCR和提取質(zhì)粒、PCR擴(kuò)增檢測(cè)，結(jié)果表明重組質(zhì)粒已導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101中。 5.煙草遺傳轉(zhuǎn)化及檢測(cè)　　通過(guò)對(duì)影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)煙草遺傳轉(zhuǎn)化的幾個(gè)主要因素的探討，確定了各主要影響因素的值。利用綠色熒光蛋白檢測(cè)系統(tǒng)