利用DDRT-PCR技術(shù)研究AM真菌浸染紫穗槐過(guò)程中相關(guān)基因.pdf

1、叢枝菌根(arbuscular mycorrhiza,AM)是一種廣泛存在的內(nèi)生菌根,能增強(qiáng)植物對(duì)礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素(尤其是磷元素)和水分的吸收,減緩干旱危害和保持土壤結(jié)構(gòu),促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。AM共生過(guò)程是一個(gè)多方面參與并精細(xì)協(xié)調(diào)的信號(hào)事件,共生體系中的雙方相互識(shí)別并發(fā)生一系列復(fù)雜的形態(tài)學(xué)和生理學(xué)變化。本實(shí)驗(yàn)選用木本豆科植物代表樹(shù)種紫穗槐(Amorpha fruticosa)及AMF摩西球囊霉(Glomus mosseae),利用mRNA差異顯

2、示技術(shù)研究叢枝菌根共生建立過(guò)程中的信號(hào)識(shí)別相關(guān)基因,從分子水平上對(duì)菌根共生機(jī)制、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行深入研究。該研究結(jié)果對(duì)豐富和發(fā)展共生生態(tài)學(xué)具有重要的理論意義,為更好地利用固氮樹(shù)種資源、菌根技術(shù)和提高共生固氮的效率都將產(chǎn)生重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　 首先,選取三種總RNA提取的方法:Biozol法、SDS／酚法、CTAB法,對(duì)侵染率分別為0％、10％、30％、50％、100％的接種AMF(arbuseular mycorrhizalf

3、ungi,AMF)與接種滅活的AMF對(duì)照處理的紫穗槐根部提取總RNA,通過(guò)測(cè)定其吸光度值計(jì)算其純度和1.1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整度,結(jié)果表明,在五個(gè)不同侵染率,均為Biozol法提取的總RNA純度高,質(zhì)量好,且提取時(shí)間較短僅需2-3h。將效果較好的Biozol方法提取的侵染率為0％(前期)和30％(后期)的總RNA進(jìn)行純化并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。其次,用20條隨機(jī)引物和3條錨定引物擴(kuò)增cDNA,PCR產(chǎn)物經(jīng)6％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分

4、離。本試驗(yàn)共獲得了169條差異顯示的表達(dá)片段,前期為63條,后期106條。對(duì)169條中的30條進(jìn)行反Northern雜交驗(yàn)證。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì),前期的差異片段陽(yáng)性率為42％,而后期的假陽(yáng)性率較高為61％,共得到12條陽(yáng)性差異片段。
　　 最后,對(duì)陽(yáng)性差異條帶進(jìn)行克隆測(cè)序,大部分為250-500bp左右。并且已經(jīng)提交NCBI上的EST庫(kù),其在GenBank上的序列號(hào)為:GW317173,GW327914,GW327915,GW327873

5、,GW327874,GW327875,GW327876,GW327877,GW327878,GW327879,GW327880,GW327881。同時(shí),對(duì)12條差異片段進(jìn)行Blastx比對(duì)分析,其中,DD-1與蓖麻屬的假定蛋白相似性較高,DD-2與同源域-亮氨酸拉鏈蛋白有關(guān),調(diào)控植物特有的發(fā)育進(jìn)程,以及對(duì)包括外界脅迫在內(nèi)的環(huán)境信號(hào)的應(yīng)答；DD-3與ATP結(jié)合盒蛋白有關(guān),可以幫助代謝產(chǎn)物、離子、糖、氨基酸、脂類、固醇以及藥物等多種底物通過(guò)

6、細(xì)胞內(nèi)、外膜；DD-4與阿耶羅菌屬和青霉菌屬的假定蛋白相似；DD-5與大麥的呼吸氧化酶基因相似,在菌根共生的前期階段,形成叢枝菌根時(shí),最明顯的植物生理變化就是植物的呼吸作用增加；DD-7與黃桿菌屬的基因組有較大的相似性；DD-8與乙酰轉(zhuǎn)移酶相關(guān),對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和活性產(chǎn)生重大影響；DD-9與阿耶羅菌屬假定蛋白相似性較高；DD-10與苜蓿中核糖核酸酶H相似；DD-11在擬南芥中克隆的轉(zhuǎn)座子基因序列相似；DD-12與色素蛋白有關(guān),而色素蛋白