雌激素及chOPG對(duì)雞胚BMSCs誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期以及BGP與Col I mRNA表達(dá)的影響.pdf

1、骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量低下和骨結(jié)構(gòu)破壞為特征的疾病,可導(dǎo)致骨強(qiáng)度降低,骨折危險(xiǎn)性增加。骨保護(hù)素(OPG)屬于TNF受體家族成員,主要由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)和成骨細(xì)胞(OB)分泌,能抑制破骨細(xì)胞(OC)生成、活化,減少骨吸收,增加骨密度。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞均可表達(dá)雌激素受體α和β,故雌激素可能對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞的分化和功能有直接作用。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源于骨髓基質(zhì)的一種間充質(zhì)細(xì)胞,它具有多種分化潛能,可向成骨細(xì)胞、

2、成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等方向分化。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過程需要誘導(dǎo)成骨細(xì)胞條件培養(yǎng)基。雌激素、OPG和BMSCs三者之間的緊密聯(lián)系及相互作用,為探討蛋雞髓質(zhì)骨形成、骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)理及其防治提供理論依據(jù)。
　　 試驗(yàn)Ⅰ雞胚BMSCs的成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)與鑒定
　　 目的:探討18日齡雞胚骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)體外培養(yǎng)生長(zhǎng)規(guī)律以及定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞的條件和誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞的功能。方法:沖洗脛骨骨髓,以全骨髓

3、貼壁法進(jìn)行體外貼壁培養(yǎng)、傳代。取第三代細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng),同時(shí)設(shè)空白對(duì)照.倒置顯微鏡下觀察其形態(tài),通過MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖率,經(jīng)Annexin V-FITC和PI染色后,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期情況。用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽(BCIP)/氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)底物顯色試劑檢測(cè)堿性磷酸酶(ALP),Van-Gieson染色檢測(cè)Ⅰ型膠原,茜素紅染色檢測(cè)鈣結(jié)節(jié)。結(jié)果:全骨髓貼壁培養(yǎng)法可獲得BMSCs,BMSCs和誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞具有活躍的

4、增殖能力。誘導(dǎo)培養(yǎng)后,ALP檢測(cè)、Ⅰ型膠原染色與鈣化結(jié)節(jié)染色均為強(qiáng)陽(yáng)性。結(jié)論:雞胚BMSCs易于體外分離培養(yǎng)、擴(kuò)增,并可定向誘導(dǎo)為典型的成骨細(xì)胞。
　　 試驗(yàn)Ⅱ17β-E2對(duì)雞胚BMSCs誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞ALP活性、OPG、BGP與ColⅠ mRNA表達(dá)的影響
　　 目的:觀察17β-雌二醇(17β-E2)對(duì)雞胚骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞的作用,為探索髓質(zhì)骨形成及其蛋雞骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機(jī)理提供理論基礎(chǔ)

5、。方法:體外分離培養(yǎng)雞胚骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,利用貼壁法純化細(xì)胞。取第三代細(xì)胞進(jìn)行成骨細(xì)胞誘導(dǎo),將誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分為5個(gè)試驗(yàn)組,分別添加含有10-7、10-8、10-9、10-10、10-11mol·濃度17β-E2的成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基,同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組。用MTT法測(cè)定不同濃度17β-E2下的生長(zhǎng)曲線,利用PNPP法測(cè)定堿性磷酸酶活性,選擇其最有效濃度。并使用該有效濃度作用于誘導(dǎo)培養(yǎng)的成骨細(xì)胞,通過流式細(xì)胞術(shù)觀察該濃度17β-E2對(duì)成骨細(xì)胞

6、凋亡的影響；使用RT-PC賊術(shù)觀察17β-E2對(duì)誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞OPG、骨鈣素(BGP)、Ⅰ型膠原(ColⅠ)的mRNA影響。結(jié)果:與對(duì)照組比較,17β-E2能夠促進(jìn)誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞增殖,ALP分泌,抑制成骨細(xì)胞凋亡,濃度為10-9 mol·L-1的17β-E2促進(jìn)OPG、BGP與colⅠ mRNA表達(dá),差異顯著。結(jié)論:10-9 mol·L-1的17β-E2可增強(qiáng)雞胚BMSCs誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞功能。
　　 試驗(yàn)Ⅲ chOPG對(duì)雞胚BM

7、SCs誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞ALP活性及BGP與ColⅠ mRNA表達(dá)的影響
　　 目的:研究外源性雞骨保護(hù)素蛋白(chOPG)對(duì)雞胚BMSCs誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞增殖、ALP活性、細(xì)胞凋亡及BGP-與ColⅠ mRNA的表達(dá)作用,探討其在蛋雞髓質(zhì)骨形成過程中的調(diào)節(jié)作用及其蛋雞骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。方法:沖洗脛骨骨髓,以全骨髓貼壁法進(jìn)行體外培養(yǎng),貼壁傳代。將第三代細(xì)胞誘導(dǎo)成成骨細(xì)胞培養(yǎng)。同時(shí)將誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分為3個(gè)試驗(yàn)組,同時(shí)設(shè)立空

8、白對(duì)照,分別添加含有終濃度為4.0 mg·mL-1,0.4 mg·mL-1,0.04 mg·mL-13種濃度的chOPG的成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化液,用MTT法測(cè)定成骨細(xì)胞的增殖,利用PNPP法測(cè)定ALP,篩選出chOPG最有效濃度培養(yǎng)BMSCs誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞,通過流式細(xì)胞術(shù)觀察其對(duì)成骨細(xì)胞凋亡的影響。使用RT-PCR技術(shù)觀察外源性chOPG對(duì)BMSCs誘導(dǎo)的成骨中BGP、ColⅠ的mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果:獲得的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞其生化指標(biāo)

9、穩(wěn)定,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨細(xì)胞分化后,ALP分泌明顯增加,可產(chǎn)生大量的礦化結(jié)節(jié),具有成熟成骨細(xì)胞的表型特征。加入外源性chOPG后,與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組成骨細(xì)胞的增殖、ALP分泌均顯著下降、細(xì)胞的凋亡增加。RT-PCR檢測(cè)顯示,與對(duì)照組相比,誘導(dǎo)培養(yǎng)基中chOPG為0.4 mg·mL-1時(shí),誘導(dǎo)培養(yǎng)的成骨細(xì)胞BGP和colⅠ mRNA的表達(dá)顯著下降。結(jié)論:外源性chOPG對(duì)體外雞胚BMSCs誘導(dǎo)培養(yǎng)成骨細(xì)胞增殖、ALP分泌有抑制作用,對(duì)