引入甘氨酸甲基化合成甜菜堿途徑提高黑麥草抗旱性研究.pdf

1、黑麥草是世界范圍內(nèi)廣泛種植的冷季型牧草和草坪草。一年生黑麥草(Lolium multiflorum Lam.)和多年生黑麥草(Lolium perenne L.)是兩個(gè)重要的黑麥草栽培種。由于黑麥草高度自交不親和，通過(guò)傳統(tǒng)育種方法進(jìn)行遺傳改良復(fù)雜而困難?；蚬こ碳夹g(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，打破了物種間基因流動(dòng)的限制，能將外源基因?qū)敫牧贾参锾囟ǖ男誀?。目前，全球水資源短缺問(wèn)題日益嚴(yán)峻，干旱嚴(yán)重影響作物產(chǎn)量，而黑麥草耐旱能力弱。因此提高抗旱性是黑麥

2、草育種的主要目標(biāo)之一，利用生物技術(shù)培育黑麥草抗旱新品種具有重要的經(jīng)濟(jì)意義和科學(xué)意義。
　　 甘氨酸甜菜堿(簡(jiǎn)稱甜菜堿)在增強(qiáng)植物抗旱性中有重要作用，通過(guò)基因工程途徑提高細(xì)胞甜菜堿含量改善植物抗逆性的研究已有較多工作。甜菜堿可通過(guò)膽堿氧化途徑和甘氨酸連續(xù)甲基化途徑合成，其中前一途徑研究較早，一些參與該途徑的酶基因已被克隆并應(yīng)用于植物抗逆基因工程研究。后一途徑近年才發(fā)現(xiàn)，目前有關(guān)參與該途徑的酶基因克隆及利用的工作報(bào)道很少。以甘氨酸為

3、底物合成甜菜堿，由于甘氨酸在細(xì)胞內(nèi)濃度較高，甜菜堿的大量積累受限較少，因此克隆相關(guān)基因的工作受到關(guān)注。本論文首先從藍(lán)細(xì)菌嗜鹽隱桿藻GR02中克隆得到兩個(gè)甲基化酶基因ApGSMT2和ApDMT2，它們?cè)谵D(zhuǎn)基因大腸桿菌和轉(zhuǎn)基因煙草中能夠有效催化甘氨酸甲基化合成甜菜堿。然后將它們插入單子葉植物表達(dá)載體中，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黑麥草從生芽塊遺傳轉(zhuǎn)化方法將ApGSMT2和ApDMT2基因轉(zhuǎn)入一年生黑麥草和多年生黑麥草中，獲得了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因株系，進(jìn)而開(kāi)

4、展轉(zhuǎn)基因黑麥草抗旱特性的研究，較深入揭示了轉(zhuǎn)基因黑麥草抗旱性提高的機(jī)理。ApGSMT2和ApDMT2基因的克隆和功能確定根據(jù)已報(bào)道的嗜鹽隱桿藻來(lái)源的甘氨酸肌氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因(ApGSMT)和二甲基甘氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因(ApDMT)序列設(shè)計(jì)PCR引物，我們從南京大學(xué)分離的嗜鹽隱桿藻GR02中克隆出兩個(gè)DNA片段，分別長(zhǎng)798 bp和834 bp，各自包含一個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)。利用生物信息學(xué)方法對(duì)這兩條DNA片段進(jìn)行序列分析和編碼產(chǎn)物

5、的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)它們與各種來(lái)源的轉(zhuǎn)甲基酶序列相似性較高，它們可能分別編碼甘氨酸肌氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶和二甲基甘氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶。將這兩條DNA片段分別命名為ApGSMT2和ApDMT2。與已報(bào)道的ApGSMT和ApDMT基因相比，ApGSMT2和ApDMT2基因與它們?cè)诤塑账崴缴闲蛄邢嗨菩苑謩e為83％和84％，氨基酸序列相似性分別達(dá)93％和91％。與其它物種的轉(zhuǎn)甲基酶相比，在氨基酸水平上，ApGSMT2與EcGSMT(來(lái)源于Ectothior

6、hodospirahalochloris，一種厭氧光合硫細(xì)菌)為64％，與AcGSDMT(來(lái)源于Actinopolysporahalophila，一種需氧異養(yǎng)真細(xì)菌)為64％；ApDMT2與EcSDMT為50％，與AcGSDMT為48％。在ApGSMT2和ApDMT2基因編碼的氨基酸序列中，存在保守的AdoMet(腺苷甲硫氨酸)結(jié)合基序：MotifⅠ，PostⅠ，MotifⅡ和MotifⅢ。蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)得出ApGSMT2和ApDMT2各

7、具有一個(gè)由7個(gè)β-折疊片構(gòu)成的“AdoMet-dependent MTase fold(AdoMet依賴的甲基轉(zhuǎn)移酶折疊)”結(jié)構(gòu)，且這7個(gè)β-折疊片是按照(6↓7↑5↓4↓1↓2↓3↓)順序排列。這個(gè)結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是甲基轉(zhuǎn)移酶(Mtases)的特征結(jié)構(gòu)。
　　 為了確定ApGSMT2和ApDMT2基因的功能，將它們共轉(zhuǎn)入E.coli和模式植物煙草中，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大腸桿菌和轉(zhuǎn)基因煙草中甜菜堿含量。在E.coli中共表達(dá)ApGSMT2和A

8、pDMT2基因?qū)е绿鸩藟A的合成量增加，與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ占?xì)胞相比，在正常培養(yǎng)條件下甜菜堿含量增加1倍左右。煙草自身不合成甜菜堿。表達(dá)ApGSMT2和ApDMT2基因的轉(zhuǎn)基因煙草(GSD株系)中能夠積累甜菜堿(可達(dá)0.4436μmol g-1FW)。與轉(zhuǎn)betA基因煙草(betA株系)相比，GSD株系的甜菜堿積累量是betA株系的4.3倍。betA基因編碼催化膽堿合成甜菜堿的酶。不同的甜菜堿積累量可能是兩種轉(zhuǎn)基因煙草合成甜菜堿的底物不同的緣故

9、，GSD株系以甘氨酸為底物，betA株系以膽堿為底物。游離甘氨酸在煙草細(xì)胞中含量豐富，而膽堿的含量比較低。在20％的PEG水溶液中，GSD株系種子萌發(fā)率高達(dá)65.2％，顯著高于betA株系(50.9％)。小苗干旱試驗(yàn)也表明，GSD植株在干旱脅迫下的生長(zhǎng)狀況遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于轉(zhuǎn)betA株系的。生理指標(biāo)檢測(cè)得出，與轉(zhuǎn)betA株系和野生型相比，干旱脅迫下GSD植株的相對(duì)含水量(RWC)較高，膜受損程度較輕，還能保持相對(duì)較高的凈光合速率和PSⅡ最大光化學(xué)

10、效率(Fv/Fm)。因而在GSD株系中，甜菜堿可能主要通過(guò)在干旱脅迫下維持細(xì)胞膜的完整性和穩(wěn)定PSⅡ中心復(fù)合體提高轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱性，抗旱能力與甜菜堿的積累量正相關(guān)。
　　 在此部分工作中，我們克隆出ApGSMT2和ApDMT2基因，它們編碼的蛋白催化甘氨酸甲基化合成甜菜堿。對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行抗旱性分析，得出GSD株系的甜菜堿積累量高于轉(zhuǎn)betA株系的，抗旱性也優(yōu)于轉(zhuǎn)betA株系的。這些結(jié)果表明ApGSMT2和ApDMT2基因在植

11、物抗逆基因工程研究中有很好的應(yīng)用前景。轉(zhuǎn)ApGSMT2和ApDMT2基因黑麥草的產(chǎn)生為了轉(zhuǎn)化單子葉植物黑麥草，將ApGSMT2和ApDMT2基因重組到一個(gè)單子葉植物表達(dá)載體質(zhì)粒上。在這個(gè)質(zhì)粒中，ApGSMT2和ApDMT2基因分別被玉米u(yù)biquitin啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。以抗除草劑草甘膦的5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(Epsps)基因?yàn)橹参镛D(zhuǎn)化選擇標(biāo)記。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的從生芽塊轉(zhuǎn)化法將ApGSMT2和ApDMT2基因轉(zhuǎn)入一年生黑麥

12、草和多年生黑麥草。通過(guò)除草劑篩選和PCR檢測(cè)選擇轉(zhuǎn)基因黑麥草植株，采用Southern雜交技術(shù)進(jìn)‘步確定外源基因是否整合入黑麥草基因組中，利用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)確定外源基因在轉(zhuǎn)基因黑麥草中的表達(dá)。從黑麥草轉(zhuǎn)化植株中選出了一批穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因材料。轉(zhuǎn)ApGSMT2和ApDMT2基因黑麥草的抗旱性分析分別以3個(gè)轉(zhuǎn)基因多年生黑麥草T0代無(wú)性系和3個(gè)來(lái)自不同轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)基因一年生黑麥草T2代株系為材料進(jìn)行抗旱性分析。把轉(zhuǎn)基因多年生黑麥草和野生型(WT)

13、的大小基本一致分蘗移栽到土質(zhì)均一的花盆中，地上部分修剪成5 cm高，恢復(fù)生長(zhǎng)4周后，停止供水進(jìn)行干旱脅迫處理。對(duì)于轉(zhuǎn)基因一年生黑麥草T2代和WT的種子播種到花盆中，經(jīng)除草劑篩選和PCR檢測(cè)后，恢復(fù)生長(zhǎng)一個(gè)月后進(jìn)行干旱脅迫處理。
　　 在干旱處理過(guò)程中，WT比轉(zhuǎn)基因黑麥草植株萎蔫早，生長(zhǎng)受抑制嚴(yán)重，而轉(zhuǎn)基因黑麥草植株根系更發(fā)達(dá)，萎蔫較晚，能夠積累更多的生物量。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的干旱脅迫處理，所有的黑麥草株系葉片卷曲，嚴(yán)重失水；但復(fù)水后轉(zhuǎn)

14、基因黑麥草植株可以較快恢復(fù)生長(zhǎng)，表現(xiàn)出較高的存活率。這些表型觀察的結(jié)果表明轉(zhuǎn)ApGSMT2和ApDMT2基因提高了黑麥草的抗旱能力。
　　 干旱處理前，轉(zhuǎn)基因多年生黑麥草和轉(zhuǎn)基因一年生黑麥草的甜菜堿含量分別為3.60～3.83μmol-1FW和2.19～2.31μmol g-1FW，與WT相比沒(méi)有明顯差異。干旱處理7天后，轉(zhuǎn)基因黑麥草和WT的甜菜堿積累量均大幅度升高，前者升高幅度更大。如轉(zhuǎn)基因多年生黑麥草L3的甜菜堿含量達(dá)17.

15、34μmol g-1FW，是WT7.91μmol g-1FW的2.19倍；轉(zhuǎn)基因一年生黑麥草L3的甜菜堿含量為6.12μmolg-1FW，是WT4.3μmol g-1FW的1.42倍。對(duì)轉(zhuǎn)ApGSMT2和ApDMT2基因黑麥草的轉(zhuǎn)基因表達(dá)分析得出，干旱脅迫下甜菜堿的含量同轉(zhuǎn)基因表達(dá)量呈正相關(guān)，即轉(zhuǎn)基因黑麥草在干旱脅迫處理中的甜菜堿增加與轉(zhuǎn)基因表達(dá)強(qiáng)度相對(duì)應(yīng)。
　　 測(cè)定轉(zhuǎn)基因黑麥草和WT在干旱處理過(guò)程中的生理指標(biāo)，以探討轉(zhuǎn)基因黑

16、麥草抗旱性提高的可能機(jī)制。干旱處理過(guò)程中所有黑麥草株系的葉片RWC和凈光合速率(Pn)均下降，但轉(zhuǎn)基因黑麥草的葉片RWC和Pn的降低幅度顯著小于WT的，并且轉(zhuǎn)基因黑麥草的離子滲漏率和丙二醛(MDA)積累水平均低于WT，即轉(zhuǎn)基因黑麥草株系的葉片細(xì)胞膜受損程度較輕。這些結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因黑麥草的甜菜堿含量增加有效地穩(wěn)定了細(xì)胞膜的完整性，這可能是葉片保持相塒較高RWC和Pn的原因之一。同WT相比，干旱脅迫過(guò)程中轉(zhuǎn)基因黑麥草株系能保持相對(duì)較高的Pn

17、，一部分歸因于輕微干旱下較高的氣孔導(dǎo)度(gS)能夠保證CO2供應(yīng)，另一方面歸因于PSⅡ中心復(fù)合體在嚴(yán)重脅迫下受損較輕。干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因黑麥草的Fv/Fm值高于WT，表明更多甜菜堿的積累可能也有效地保護(hù)PSⅡ中心復(fù)合體結(jié)構(gòu)及功能。由于在干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因黑麥草能保持較強(qiáng)的光合能力，因此葉片可積累較多的可溶性糖。
　　 高等植物中各氨基酸的合成途徑之間存在密切聯(lián)系，一種氨基酸量的變化有可能影響整個(gè)游離氨基酸庫(kù)。考慮到轉(zhuǎn)基因黑麥草消耗甘

18、氨酸合成甜菜堿，有必要分析轉(zhuǎn)基因黑麥草中各游離氨基酸的水平。干旱處理前轉(zhuǎn)基因黑麥草和WT的各游離氨基酸含量沒(méi)有顯著差異。干旱處理7天，轉(zhuǎn)基因一年生黑麥草的Gly、Ser和Thr含量顯著低于WT的，而轉(zhuǎn)基因多年生黑麥草中僅有Gly顯著低于WT。這可能是因?yàn)檗D(zhuǎn)基因黑麥草中，Gly被消耗合成甜菜堿，需較多的Ser用于Gly合成的結(jié)果。干旱脅迫下，植物能夠積累游離氨基酸，尤其是Pro作為滲透調(diào)節(jié)保護(hù)物質(zhì)。干旱脅迫后轉(zhuǎn)基因黑麥草和WT的游離氨基酸

19、總量和Pro含量均大幅度增加，但轉(zhuǎn)基因材料和WT之間沒(méi)有明顯差異，這表明同WT相比，轉(zhuǎn)基因黑麥草抗旱能力的提高與游離氨基酸總量和Pro含量變化無(wú)關(guān)。
　　 檢測(cè)轉(zhuǎn)基因多年生黑麥草中干旱脅迫相關(guān)基因的表達(dá)變化，探討引入新的甜菜堿合成途徑對(duì)其他基因表達(dá)的影響。選擇的基因有兩個(gè)DREB/CBF轉(zhuǎn)錄因子基因的同源基因、D1蛋白編碼基因、催化合成膽堿的磷酸膽堿胞苷酰轉(zhuǎn)移酶基因和AQPs基因等。AQPs是水通道蛋白，植物可以通過(guò)控制AQPs

20、活性來(lái)抵御干旱脅迫，比較分析4個(gè)多年生黑麥草的水通道蛋白基因的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)LpTIR2:1和LpTIR1:2基因的表達(dá)在轉(zhuǎn)基因植株和WT間有差異，黑麥草積累更多甜菜堿可能促進(jìn)了它們的表達(dá)。但是多數(shù)基因的表達(dá)趨勢(shì)在轉(zhuǎn)基因株系和WT之間無(wú)明顯差別，即未受到轉(zhuǎn)基因的影響。
　　 在此部分研究中，通過(guò)轉(zhuǎn)ApGSMT2和ApDMT2基因，將甘氨酸甲基化合成甜菜堿途徑首次引入黑麥草中。異源表達(dá)ApGSMT2和ApDMT2基因增加了黑麥草中

21、甜菜堿的積累量，抗旱能力得到顯著提高。生理學(xué)和分子生物學(xué)分析表明干旱脅迫下在轉(zhuǎn)基因黑麥草中甜菜堿不僅能夠穩(wěn)定細(xì)胞膜的完整性和PSⅡ中心復(fù)合體，而且還可能影響一些脅迫相關(guān)基因的表達(dá)。
　　 綜上所述，本工作克降出編碼催化甘氨酸甲基化合成甜菜堿的ApGSMT2和ApDMT2基因，通過(guò)轉(zhuǎn)基因植物證實(shí)了其應(yīng)用價(jià)值，豐富了抗逆植物基因工程研究的基因資源。另外，獲得了抗旱性明顯提高的轉(zhuǎn)基因黑麥草材料，為我國(guó)黑麥草育種工作做出力所能及的貢獻(xiàn)；