禾谷類作物甜菜堿合成途徑基因的轉(zhuǎn)錄后加工及其特征的研究.pdf

1、甘氨酸甜菜堿(glycein betaine)屬于季銨類化合物，是被用作滲透壓保護(hù)劑的少數(shù)有機(jī)化合物之一，在細(xì)菌、藻類和一些高等植物以及動物中廣泛存在。在植物中已證實甘氨酸甜菜堿可以提高植物抗鹽、高溫、冷凍脅迫的能力，并保持PSII復(fù)合體和Rubisco的結(jié)構(gòu)與活性。在已研究的多數(shù)生物系統(tǒng)中通過膽堿途徑合成甘氨酸甜菜堿，在植物中普遍采用兩步法合成，即膽堿在膽堿單加氧酶(choline monoxygenase，CMO)和甜菜堿醛脫氫酶(

2、betaine aldehyde dehydrogenase，BADH)催化下經(jīng)過兩次氧化反應(yīng)生成甘氨酸甜菜堿。 在已研究植物系統(tǒng)中普遍存在兩個BADH同源基因，雖然已從分子水平表明多種植物中甘氨酸甜菜堿合成途徑相關(guān)基因的存在，但實際上植物積累甘氨酸甜菜堿的能力完全不同。重要糧食作物水稻對環(huán)境脅迫敏感，不積累甘氨酸甜菜堿。本研究通過對水稻多種誘導(dǎo)條件下兩個BADH基因轉(zhuǎn)錄本的克隆分析表明，在BADH基因5’端外顯子區(qū)域有缺失或外

3、源基因插入。經(jīng)序列分析，BADH基因5’端序列的缺失/插入將導(dǎo)致移碼而提前終止以及翻譯起始密碼或功能結(jié)構(gòu)域的丟失。小麥、玉米、大麥也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，但雙子葉植物菠菜、擬南芥和蕃茄的BADH基因及水稻的BADH-like基因則被正常剪接。 水稻基因組中除有2個BADH基因外，也包含一個CMO基因，但卻不積累甘氨酸甜菜堿。與菠菜CMO編碼蛋白的比較表明，水稻CMO也具有[2Fe-2S]結(jié)構(gòu)域和一個保守的非亞鐵血紅素鐵結(jié)合域，可以組成C

4、MO的活性中心，但卻未檢測到水稻的CMO活性。本研究通過對水稻多種誘導(dǎo)條件下CMO基因轉(zhuǎn)錄本的克隆分析表明，在大量CMO基因轉(zhuǎn)錄本中有5’端編碼區(qū)序列缺失，及多種選擇性剪接事件特別是第2外顯子保留的發(fā)生。經(jīng)序列分析，CMO基因轉(zhuǎn)錄本的異常加工將導(dǎo)致移碼后提前終止及翻譯起始密碼或功能結(jié)構(gòu)域的丟失。玉米中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，但菠菜的CMO基因則被正常剪接。BADH和CMO基因在轉(zhuǎn)錄后加工方式上的不同可能是造成植物物種間甘氨酸甜菜堿積累不同的原因

5、。對兩個BADH和CMO基因大量轉(zhuǎn)錄本的序列分析也表明，有相似序列成對存在于異常加工轉(zhuǎn)錄本的缺失/插入位點兩側(cè)，(命名為short-direct repeats，SDR)。不同脅迫條件下缺失位點的選擇也發(fā)生變化，表明SDR序列元件可能與這種轉(zhuǎn)錄后加工方式對缺失/插入位點的識別有關(guān)。 利用水稻BADH和CMO基因中的缺失序列在水稻基因數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，選取帶有SDRs的候選基因，在不同條件水稻樣品中進(jìn)行RT-PCR和序列分析以對其

6、加工方式進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，大部分候選基因有類似于水稻BADH和CMO基因的轉(zhuǎn)錄后加工，在這些候選基因缺失/插入序列的5'和3'端也存在類似的SDR序列，此外，也發(fā)現(xiàn)發(fā)生于同一基因的反式作用。擬南芥結(jié)合蛋白候選基因測序結(jié)果顯示，其中1個基因除正常剪接、選擇性剪接外，也有兩端存在SDR序列的序列缺失以及部分外顯子序列的重復(fù)，而這種序列缺失和重復(fù)在基因組水平則未檢測到。 對本研究中檢測基因的基因結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行初步分析，結(jié)果提示：這一過