引入甘氨酸甜菜堿合成途徑提高小麥抗逆性研究.pdf

1、小麥(Triticum aestivum L.)是世界上分布最廣、種植面積最大的糧食作物之一。隨著人口增多和自然環(huán)境的不斷惡化、水資源短缺以及土壤鹽堿化程度的日趨嚴(yán)重,小麥的需求量與供應(yīng)量之間的矛盾也愈來(lái)愈突出,培育抗逆小麥品種及增加小麥產(chǎn)量已成為當(dāng)務(wù)之急。
　　 傳統(tǒng)的小麥育種主要利用品種間雜交來(lái)培育新品種,采用遠(yuǎn)緣雜交和誘變育種等方法創(chuàng)造新種質(zhì)。經(jīng)過長(zhǎng)期努力,小麥的產(chǎn)量逐漸提高,品質(zhì)不斷得到改進(jìn)。然而近年來(lái),由于可利用的種質(zhì)

2、資源限制,大大制約了常規(guī)育種工作的成效。遠(yuǎn)緣雜交雖然創(chuàng)造了大量的育種材料,但這些材料一般存在著某些缺點(diǎn),需要經(jīng)過多代選擇才能直接用于小麥育種。基因工程技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用,打破了物種間基因流動(dòng)的限制,能將外源基因?qū)胄←溂?xì)胞并獲得轉(zhuǎn)基因植株,為小麥育種開辟了新途徑。利用生物技術(shù)提高小麥耐鹽抗旱性具有重要的戰(zhàn)略意義。
　　 由于小麥遺傳轉(zhuǎn)化難度大,基因組龐大,且實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng),盡管小麥抗逆基因工程研究倍受重視,但發(fā)展速度仍落后于水稻、玉米

3、、棉花等農(nóng)作物,利用基因工程方法培育小麥抗旱耐鹽品種是小麥生物技術(shù)研究的一個(gè)重要課題。本論文以發(fā)展本實(shí)驗(yàn)室已初步建立的小麥莖尖遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系為起點(diǎn),通過向小麥優(yōu)良品種中引入甘氨酸甜菜堿合成途徑的酶基因(來(lái)自大腸桿菌的編碼膽堿脫氫酶基因betA、來(lái)自耐鹽藻青菌的甘氨酸肌氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因ApGSMT2和肌氨酸二甲基甘氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因ApDMT2),開展提高小麥抗旱耐鹽性的研究。
　　 一、轉(zhuǎn)基因小麥的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)基因表達(dá)分析

4、>　　 以小麥優(yōu)良品種濟(jì)南17、濟(jì)麥19和濟(jì)麥22為受體,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的莖尖遺傳轉(zhuǎn)化法分別將betA、ApGSMT2和ApDMT2導(dǎo)入小麥細(xì)胞中,通過除草劑抗性(選擇標(biāo)記基因?yàn)閎ar或epsp,它們編碼的酶分別抗除草劑草丁膦和草甘膦)篩選和分子檢測(cè)(PCR、Southern雜交),篩選出來(lái)自濟(jì)南17的15個(gè)轉(zhuǎn)betA基因的株系、來(lái)自濟(jì)麥19的27個(gè)轉(zhuǎn)ApGSMT2和ApDMT2基因的株系、來(lái)自濟(jì)麥22的27個(gè)轉(zhuǎn)ApGSMT2和ApD

5、MT2基因的株系。在適宜條件下,遺傳轉(zhuǎn)化頻率在3.67％-5.35％之間。轉(zhuǎn)基因植株的Southern雜交結(jié)果表明,外源基因已經(jīng)整合到小麥基因組中并在后代中穩(wěn)定遺傳,外源基因的拷貝數(shù)為1～2個(gè)。RT-PCR結(jié)果表明外源基因在小麥中能夠活躍表達(dá),但表達(dá)強(qiáng)度在不同株系中有明顯差異。
　　 取3個(gè)轉(zhuǎn)betA基因純合的株系BL1、BL2和BL3的T2代植株以及野生型(濟(jì)南17)植株進(jìn)行鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因表達(dá)分析。Real-time RT-P

6、CR結(jié)果表明,在野生型植株中沒有檢測(cè)到betA基因轉(zhuǎn)錄本；在鹽脅迫處理前,盡管轉(zhuǎn)基因由組成型強(qiáng)啟動(dòng)子Ubiquitin啟動(dòng),betA基因的表達(dá)豐度只有小麥actin表達(dá)豐度的1％左右；200 mMNaCl處理12天,3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的betA基因表達(dá)量分別增加了6.3倍、8.8倍和10.3倍。甘氨酸甜菜堿含量測(cè)定結(jié)果表明,鹽脅迫處理前,轉(zhuǎn)基因株系BL1、BL2和BL3的葉片甘氨酸甜菜堿含量為116.5-134.9μmol g-1 DW,顯

7、著高于野生型的(106.0μmol g-1 DW)；200 mM NaCl處理12天,轉(zhuǎn)基因株系BL1、BL2和BL3植株的甘氨酸甜菜堿水平分別升高到179.7、281.2和363.0μmol g-1 DW,分別是野生型(157.4μmol g-1 DW)的1.1、1.8和2.3倍。推測(cè)在鹽脅迫條件下betA基因的轉(zhuǎn)錄本半衰期增長(zhǎng),以致細(xì)胞合成更多的甘氨酸甜菜堿。
　　 選取轉(zhuǎn)betA基因純合的株系BL6、BL7和BL9的T3代

8、以及濟(jì)南17(野生型對(duì)照)的植株進(jìn)行干旱條件下的轉(zhuǎn)基因表達(dá)分析。未經(jīng)干旱處理前,BL6、BL7和BL9的betA基因表達(dá)豐度是小麥actin的1％左右,干旱脅迫處理7天,3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的betA基因表達(dá)量分別增加了4.3倍、8.3倍和5.2倍。葉片甘氨酸甜菜堿含量測(cè)定結(jié)果顯示,干旱處理前,3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的含量為82.6-97.1μmol g-1 DW,顯著高于野生型的(72.1μmol g-1 DW)；干旱處理7天,轉(zhuǎn)基因株系的甘氨酸甜

9、菜堿含量分別上升到194.1、281.9和250.0μmol g-1 DW,是野生型(143.7μmol g-1 DW)的1.4、2.0和1.7倍。作為細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)劑和大分子結(jié)構(gòu)保護(hù)物質(zhì),葉片甘氨酸甜菜堿含量顯著增加有利于細(xì)胞在脅迫條件下維持正常的功能。
　　 取轉(zhuǎn)入ApGSMT2和ApDMT2基因的T1小麥植株和野生型植株(分別為濟(jì)麥19和濟(jì)麥22)的葉片進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),基因ApGSMT2在轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)強(qiáng)度有差異,

10、來(lái)自濟(jì)麥19的5個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中A-19L4的表達(dá)量最低,A-19L5的表達(dá)量最高；來(lái)自濟(jì)麥22的5個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中A-22L1的表達(dá)量最低,A-22L4和A-22L5株系表達(dá)強(qiáng)度高。甘氨酸甜菜堿含量測(cè)定結(jié)果表明,正常條件下,不同品種的轉(zhuǎn)基因植株葉片甘氨酸甜菜堿含量高于野生型的,差異都達(dá)到極顯著水平(P<0.01,n=4)。濟(jì)麥19的轉(zhuǎn)基因植株甘氨酸甜菜堿含量(84.8-113.0μmol g-1 DW)比野生型濟(jì)麥19(72.2μmol

11、g-1DW)高17％-56％,濟(jì)麥22的轉(zhuǎn)基因植株甘氨酸甜菜堿含量比野生型濟(jì)麥22(74.3μmol g-1 DW)高27％-55％?？梢缘贸鰜?lái)自低等真核細(xì)胞的ApGSMr2和ApDMT2基因在導(dǎo)入小麥后,轉(zhuǎn)基因編碼產(chǎn)物能夠有效提高小麥的甘氨酸甜菜堿含量。
　　 二、轉(zhuǎn)betA基因小麥的耐鹽性分析
　　 選取轉(zhuǎn)betA基因純合的T2代小麥株系BL1、BL2和BL3進(jìn)行耐鹽性分析,確定轉(zhuǎn)基因betA能否提高小麥耐鹽性以及耐

12、鹽性提高的機(jī)制。冬小麥對(duì)鹽脅迫的敏感期分別是出苗及小苗階段和早春返青期,耐鹽性強(qiáng)弱最終表現(xiàn)在鹽堿地的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量。本工作重點(diǎn)檢測(cè)了小麥出苗及小苗階段的耐鹽性,并在濱海鹽堿地進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因小麥的田間實(shí)驗(yàn)。
　　 將轉(zhuǎn)基因株系的種子和野生型的種子播于大小一致的沙盆中,分別澆灌含不同濃度NaC1(0、100 mM、200 mM、300 mM)溶液,統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)率和觀察長(zhǎng)勢(shì)。轉(zhuǎn)基因株系的種子在鹽脅迫條件下萌發(fā)率顯著高于野生型,小苗生長(zhǎng)較好。其

13、中株系BL3在200 mM NaCl濃度處理下萌發(fā)率為94％,約為野生型的1.45倍,小苗受害程度較輕。
　　 將轉(zhuǎn)基因株系和野生型的種子播在沙盆中,出苗后澆灌Hoagland營(yíng)養(yǎng)液,5葉期開始在營(yíng)養(yǎng)液中加入NaCl進(jìn)行鹽脅迫處理,NaCl濃度以每天50 mM遞增至終濃度為200 mM。鹽脅迫處理后,轉(zhuǎn)基因植株的長(zhǎng)勢(shì)明顯優(yōu)于野生型植株,處理12天后BL2和BL3植株的地上部分生物量分別比野生型的高23.7％和33.8％,根生物量

14、分別比野生型的高18.9％和34.1％。
　　 在鹽脅迫條件下,無(wú)論轉(zhuǎn)基因植株還是野生型植株,葉片和根中的Na+含量都明顯升高,K+含量先略有升高而后降低。與野生型相比,轉(zhuǎn)基因植株Na+增加量少,K+降低幅度小。在株系。BL2、BL3的根和葉片中,Na+、K+含量與野生型的相比均差異顯著,并且K+/Na+比值顯著高于野生型的。在鹽脅迫條件下,所有株系的葉綠素含量均是先有小幅度升高然后下降,但轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素含量在處理期后期顯著

15、高于野生型的。在脅迫12天時(shí),株系BL2和BL3的葉綠素含量分別比野生型的高2倍和2.1倍。光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度以及PSⅡ光化學(xué)效率的測(cè)定結(jié)果顯示,在短期鹽脅迫處理下,光合速率即明顯降低,降低主要由氣孔導(dǎo)度降低引起；在長(zhǎng)期鹽脅迫處理下,光合速率大幅度降低是由于氣孔導(dǎo)度降低和PSⅡ復(fù)合體活性受抑制共同造成的。與野生型相比,轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出明顯較高的光合速率、氣孔導(dǎo)度和最大光化學(xué)效率(Fv/Fm),表明在鹽脅迫處理中能合成較多

16、的碳水化合物。
　　 鹽脅迫條件下,葉細(xì)胞溶質(zhì)勢(shì)隨著脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低,但轉(zhuǎn)基因株系BL2和BL3的溶質(zhì)勢(shì)顯著低于野生型的,即具有更強(qiáng)的保水和吸收水分的能力。與野生型相比,轉(zhuǎn)基因植株葉片含有較多的可溶性糖和脯氨酸。這些結(jié)果表明,在鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)基因株系BL2和BL3細(xì)胞內(nèi)積累了較多的可溶性物質(zhì)(包括脯氨酸、可溶性糖和GB等),使細(xì)胞維持較低的溶質(zhì)勢(shì),有利于細(xì)胞正常代謝和光合作用以及植株的生長(zhǎng)。
　　 在鹽脅迫條

17、件下,轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出較低的MDA水平和離子滲漏率,表明細(xì)胞膜受損程度小于野生型的,這與轉(zhuǎn)基因植株中積累較高的甘氨酸甜菜堿水平呈顯著負(fù)相關(guān),與轉(zhuǎn)基因植株有較高的PSⅡ活性相一致。表明甘氨酸甜菜堿在轉(zhuǎn)基因植株中的過量積累對(duì)生物膜的穩(wěn)定性和生物大分子功能產(chǎn)生了有益的保護(hù)作用。
　　 在濱海鹽堿地種植的轉(zhuǎn)基因株系和野生型對(duì)照(濟(jì)南17)的試驗(yàn)結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因株系尤其是BL2和BL3在鹽堿地中的存活率和生長(zhǎng)發(fā)育明顯優(yōu)于野生型的,經(jīng)濟(jì)性狀