石河子地區(qū)棉鈴蟲抗藥性監(jiān)測(cè)及CYP6AE14和AK基因的克隆.pdf

1、棉鈴蟲 [Helicoverpa armigera (Hübner)] 屬于鱗翅目夜蛾科實(shí)夜蛾亞科棉鈴蟲屬，是目前棉花生產(chǎn)的主要害蟲之一，棉鈴蟲對(duì)殺蟲劑的抗性是長(zhǎng)久以來受到密切關(guān)注的重要問題。因此，經(jīng)過調(diào)查，本實(shí)驗(yàn)利用丙溴磷、高效氯氰菊酯、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽和賽丹4種常用殺蟲劑對(duì)石河子地區(qū)的農(nóng)試場(chǎng)、桃花鎮(zhèn)、泉水地鎮(zhèn)等3個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Hübner)種群采用FAO推薦的微量點(diǎn)滴法進(jìn)行抗性測(cè)定。試

2、驗(yàn)結(jié)果表明：石河子地區(qū)3個(gè)棉區(qū)棉鈴蟲種群均對(duì)高效氯氰菊酯產(chǎn)生了低水平抗性，抗性倍數(shù)分別為5.38倍、7.47倍、7.88倍;對(duì)賽丹、丙溴磷及甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽3種藥劑沒有產(chǎn)生明顯的抗性水平。同時(shí)，對(duì)石河子地區(qū)棉鈴蟲與敏感品系棉鈴蟲體內(nèi)的幾類主要解毒酶進(jìn)行了酶蛋白的含量及比活力測(cè)定，以比較石河子地區(qū)棉鈴蟲與敏感品系棉鈴蟲酶蛋白含量及活性的差異，結(jié)果表明，石河子地區(qū)棉鈴蟲體內(nèi)的多功能氧化酶的酶原含量及比活力均高于敏感品系棉鈴蟲且差異顯著

3、，而羧酸酯酶、磷酸酯酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的酶原含量及比活力的差異性不顯著。
　　 細(xì)胞色素P450氧化酶系是一類廣泛分布于生物有機(jī)體中的重要酶系，它能夠代謝多種內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)，因其生物學(xué)的重要性，一直是生物學(xué)領(lǐng)域研究的一個(gè)重要對(duì)象。為此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)棉鈴蟲P450 CYP6AE14基因進(jìn)行了克隆和序列分析，并在原核細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)。根據(jù)已發(fā)表的棉鈴蟲CYP6AE14的基因設(shè)計(jì)出一對(duì)特異性引物，利用PCR的方法獲得CYP6

4、AE14的全長(zhǎng)基因序列，該序列長(zhǎng)1581bp，編碼527個(gè)氨基酸，與陳曉雅老師測(cè)得的該基因序列對(duì)比中發(fā)現(xiàn)，石河子地區(qū)棉鈴蟲體內(nèi)該基因堿基序列的第74、1059、1086、1113和1545位置上堿基與陳曉雅老師所測(cè)得相同位置的堿基是不同的，而在翻譯編碼的氨基酸序列中，只有第74位堿基對(duì)氨基酸的編碼產(chǎn)生影響，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，其他4處堿基沒有對(duì)編碼的氨基酸產(chǎn)生影響。利用原核表達(dá)載體PET28-a在大腸桿菌中表達(dá)了棉鈴蟲細(xì)胞色素P450

5、 CYP6AE14基因，并通過聚丙烯酰胺凝膠電泳驗(yàn)證P450蛋白質(zhì)的表達(dá)，在50 kD左右出現(xiàn)誘導(dǎo)目的條帶，為進(jìn)一步的基因功能驗(yàn)證莫定了基礎(chǔ)。
　　 在昆蟲生命活動(dòng)過程中，精氨酸激酶 (Arginine kinase，AK) 是其體內(nèi)主要的磷酸原激酶，它通過催化精氨酸和 ATP之間的可逆性反應(yīng)，將能量存儲(chǔ)于磷酸精氨酸的高能磷酸鍵中，或?qū)⒘姿峋彼岱纸猱a(chǎn)生 ATP，對(duì)昆蟲體內(nèi)的能量代謝、儲(chǔ)存和利用起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。由于精氨酸激酶僅

6、存在于無脊椎動(dòng)物中，并且該酶及其磷酸原的能量代謝途徑與哺乳動(dòng)物中的完全不同，因此精氨酸激酶可以作為控制昆蟲的一個(gè)很好的敏感靶標(biāo)。為此，本研究對(duì)棉鈴蟲精氨酸激酶進(jìn)行了克隆、表達(dá)，AK基因序列全長(zhǎng)為為1068bp，編碼355個(gè)氨基酸，分子量約為40 kD。將精氨酸激酶的基因連接到原核表達(dá)載體PET-28a上并轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)。同時(shí)通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR，得知AK基因在石河子地區(qū)棉鈴蟲體內(nèi)的表達(dá)量比敏感品系棉鈴蟲體內(nèi)AK基因表達(dá)量高