UCH37對(duì)三種不同二泛素的水解作用及水解動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、本論文的主要研究內(nèi)容分為兩部分：第一部分研究了UCH37（UbiquitinC-terminal hydrolase）的UCH-domain（即N端1-227氨基酸殘基）對(duì)三種不同二泛素（Lys48-，Lys63-，線性泛素）之間異肽鍵的水解作用，同時(shí)探究用分子生物學(xué)熒光的方法檢測并計(jì)算UCH37N的水解活性。第二部分研究了Ce3+元素在缺Mg2+和有Mg2+條件下，對(duì)植物氮代謝和葉綠體抗氧化系統(tǒng)的影響。
　　 第一部分：

2、>　　 泛素羧基端水解酶是去泛素化酶五個(gè)家族中的一個(gè)，它可以特異性切除泛素羧基端融合的氨基酸或小分子。在已發(fā)現(xiàn)的UCHs家族中，UCH37是唯一能和26S蛋白酶體中的19S亞基相互作用，從遠(yuǎn)端開始水解Lys48-方式連接的多泛素鏈。目前的研究表明，UCHs家族中UCH-L1，UCH-L3不能水解Lys48-和Lys63-以及直鏈連接的四泛素。最近被報(bào)道UCH37，在PA700（19S）蛋白酶體的調(diào)節(jié)下，UCH-domain（1-228

3、）具有異肽鍵水解活性，可以水解二泛素之間的異肽鍵，同時(shí)研究表明，UCH-domain，UCH37，UCH37-Adrm1，和UCH37-Adrm1-S1復(fù)合物等都沒有水解二泛素的活性，但UCH-domain能識(shí)別泛素并水解小分子底物。我們的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，UCH37N（1-227）不僅能水解小分子底物，而且具有水解二泛素之間異肽鍵的活性，為了較系統(tǒng)的研究UCH37N對(duì)不同二泛素的水解作用及水解動(dòng)力學(xué)，我們?cè)谠吮磉_(dá)系統(tǒng)中表達(dá)UbF45W-

4、K48R，UbF45W-K63R，Ub-G75A-G76P-His6和UbF45W-Ub-G75A-G76P-His6，然后體外反應(yīng)生成UbF45W-K48R-Ub-G75AG76P-His6和UbF45W-K63R-Ub-G75AG76P-His6二泛素。加上直接表達(dá)的直鏈二泛素共三種，作為酶切反應(yīng)的底物。在反應(yīng)終止后用Ni-NTA柱親和層析的方法除去反應(yīng)體系中帶有His6-tag標(biāo)記的蛋白，然后通過熒光測定反應(yīng)產(chǎn)物UbF45W的濃度

5、，進(jìn)而比較UCH37N對(duì)三種不同二泛素的水解活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，泛素羧基端水解酶UCH37N不能水解直鏈二泛素，對(duì)另外兩種二泛素的水解活性也有一定差異，可能與UCH37在體內(nèi)的功能有關(guān)。
　　 第二部分
　　 這部分工作主要研究了在缺鎂和正常條件下Ce3+對(duì)菠菜氮代謝以及對(duì)菠菜葉綠體抗氧化系統(tǒng)的影響，主要內(nèi)容包括：
　　 1.研究了在缺鎂和正常條件下，Ce3+對(duì)菠菜氮代謝系統(tǒng)的影響。實(shí)驗(yàn)方法：將菠菜分別培養(yǎng)在缺鎂

6、和完全培養(yǎng)基中，分別對(duì)其進(jìn)行Ce3+處理，不加Ce3+處理的作為對(duì)照。培養(yǎng)一段時(shí)間后對(duì)植物體內(nèi)氮代謝各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測，如硝酸還原酶，亞硝酸還原酶，谷氨酸脫氫酶，谷氨酸合酶，谷丙轉(zhuǎn)氨酶，谷草轉(zhuǎn)氨酶等。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在缺鎂條件下，植物體內(nèi)的氮代謝受到明顯抑制，從而影響植物有機(jī)物的合成，進(jìn)而影響植物的生長。Ce3+處理后，菠菜體內(nèi)氮代謝的癥狀可以被明顯緩解，同時(shí)，有機(jī)物、葉綠素和可溶性蛋白的含量等較缺鎂條件下明顯提高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在缺鎂條件

7、下，Ce3+可以部分取代鎂促進(jìn)無機(jī)氮轉(zhuǎn)化成有機(jī)氮，進(jìn)而促進(jìn)植物的生長。
　　 2.通過檢測活性氧族在菠菜葉綠體中的積累，研究在缺鎂條件下菠菜的氧化應(yīng)激水平。缺鎂培養(yǎng)下，菠菜葉綠體中膜脂過氧化物增多，通過檢測超氧化物岐化酶，過氧化氫酶，抗壞血酸過氧化物酶，谷胱甘肽還原酶的活性以及抗氧化劑谷胱甘肽和類胡蘿卜素的含量，結(jié)果表明活性氧族的攻擊激活抗氧還原化系統(tǒng)的抵御。研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)缺鎂培養(yǎng)下，菠菜葉綠體中抗氧化能力下降，明顯抑制植株的生