去泛素化酶UCH37對(duì)肝癌復(fù)發(fā)的影響及其分子機(jī)制研究.pdf

1、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)泛素化和去泛素化調(diào)節(jié)的動(dòng)態(tài)平衡參與了細(xì)胞生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)，包括細(xì)胞的代謝、分化、增殖等，還能選擇性地降解或穩(wěn)定癌基因、抑癌基因的產(chǎn)物、激活物或抑制物、凋亡調(diào)控蛋白等，達(dá)到調(diào)控細(xì)胞突變和腫瘤發(fā)生的目的。目前研究證實(shí)，泛素羧基末端水解酶家族(ubiquitin C-terminal hydrolases，UCHs)是細(xì)胞內(nèi)的一種去泛素化酶。UCH家族有4個(gè)成員：UCH-L1、UCH-L3、UCH37和BRCA1相關(guān)蛋白1(BRCA

2、1-associated protein-1，BAP1)?，F(xiàn)有研究表明，UCH-L1、UCH-L3和BAP1與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后相關(guān)，但至今尚未有UCH37和惡性腫瘤之間關(guān)系的報(bào)道。因此，本研究的目的是明確UCH37在原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)中的作用，并進(jìn)一步探討其分子作用機(jī)制。本論文分成三個(gè)部分：
　　 第一部分 UCH37表達(dá)與人肝癌臨床病理特征的關(guān)系及其對(duì)肝癌患者

3、復(fù)發(fā)與預(yù)后的影響
　　 我們采用免疫組化染色方法檢測(cè)了UCH37在90例肝癌組織和相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，UCH37在肝癌組織中呈高表達(dá)；配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，UCH37在肝癌組織中的表達(dá)水平明顯高于相應(yīng)的癌旁組織；在61例肝癌復(fù)發(fā)患者中，UCH37在肝癌組織中的表達(dá)水平亦明顯高于相應(yīng)的癌旁組織。隨后，我們采用Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型，對(duì)HCC患者術(shù)后總體生存(overall survival，OS)相關(guān)危險(xiǎn)因素和至復(fù)發(fā)時(shí)間

4、(time to recurrence，TTR)相關(guān)危險(xiǎn)因素進(jìn)行了單因素和多因素分析。結(jié)果顯示，除了以往研究中公認(rèn)的HCC重要危險(xiǎn)因素--腫瘤大小和血清AFP水平，被證實(shí)為HCC復(fù)發(fā)或生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素外，UCH37在肝癌組織中的免疫組化得分與相應(yīng)癌旁組織中的得分之差大于等于2分，也被證實(shí)是影響肝癌患者根治術(shù)后TTR的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。這一部分研究提示，UCH37是一個(gè)潛在的新型HCC預(yù)后分子標(biāo)志物，且可能通過參與HCC的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移而在HCC

5、的發(fā)展演進(jìn)中發(fā)揮了重要作用。
　　 第二部分 UCH37對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　 本研究部分構(gòu)建了UCH37過表達(dá)和下調(diào)的穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞株，并對(duì)其進(jìn)行了細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，UCH37能顯著增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力；與對(duì)照相比，UCH37下調(diào)能顯著抑制細(xì)胞的增殖；與對(duì)照相比，UCH37對(duì)肝癌細(xì)胞株的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響沒有顯著性差異；在裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)中，UCH37能促進(jìn)腫瘤的形成。這一部

6、分研究結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)了UCH37具有促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的能力，結(jié)合第一部分的臨床研究結(jié)果，提示UCH37可能是通過調(diào)控肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，從而促進(jìn)了肝癌術(shù)后的復(fù)發(fā)。
　　 第三部分 UCH37促進(jìn)肝癌復(fù)發(fā)的相關(guān)機(jī)制探討
　　 在本研究部分中，一方面，我們應(yīng)用原核細(xì)胞表達(dá)、純化蛋白的技術(shù)，在體外得到了純化的GST-UCH37融合蛋白，將此融合蛋白與Huh7細(xì)胞總蛋白進(jìn)行GST-pulldown實(shí)驗(yàn)，沉淀產(chǎn)物行SDS

7、-PAGE電泳，聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)和數(shù)據(jù)庫搜索，篩選到了63個(gè)與UCH37相互作用的蛋白質(zhì)。同時(shí)，我們應(yīng)用免疫共沉淀技術(shù)在肝癌組織中分離和富集了與UCH37相互作用的蛋白質(zhì)，沉淀產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳，聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)和數(shù)據(jù)庫搜索，篩選到了22個(gè)與UCH37相互作用的蛋白質(zhì)。通過分析兩組數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)共同的蛋白質(zhì)，即駐留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)具有分子伴侶功能的葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(Glucose-regulated protein78，GRP78)。

8、通過免疫共沉淀和激光共聚焦技術(shù)證實(shí)了UCH37和GRP78之間存在相互作用。
　　 另一方面，我們應(yīng)用蛋白質(zhì)定量分析技術(shù)，即同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)，篩選到了一系列與UCH37相關(guān)的差異表達(dá)蛋白。結(jié)果顯示，與對(duì)照細(xì)胞株相比，UCH37過表達(dá)的穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞株中有18個(gè)蛋白質(zhì)上調(diào)，21個(gè)蛋白質(zhì)下調(diào)。對(duì)這39

9、個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行GO(Gene Omology，GO)數(shù)據(jù)庫和KEGG(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路分析，結(jié)果顯示，這些差異表達(dá)蛋白分布于細(xì)胞的各個(gè)亞單位，涉及各個(gè)方面的分子功能，參與了各種生物學(xué)過程，提示UCH37高表達(dá)后影響了一系列對(duì)細(xì)胞生命活動(dòng)調(diào)節(jié)具有重要作用的蛋白質(zhì)的表達(dá)。經(jīng)過篩選，我們確定將參與前體mRNA剪接和雙鏈DNA修復(fù)的蛋白質(zhì)--PRP19，作為進(jìn)一

10、步研究的蛋白質(zhì)。通過免疫共沉淀、激光共聚焦、小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)等技術(shù)，證實(shí)了UCH37通過與PRP19相互作用，對(duì)其去泛素化水平升高，使其泛素化降解減少，導(dǎo)致PRP19持續(xù)高表達(dá)，從而增強(qiáng)了肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。
　　 另外，這一部分研究篩選到了許多與UCH37相互作用或者受UCH37調(diào)控的蛋白質(zhì)，為進(jìn)一步探討UCH37在肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)中的作用機(jī)制提供了新的線索。