去泛素化酶10在過(guò)敏性哮喘中的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　本研究旨在探討去泛素化酶10(Ubiquitin-specific peptidase10,USP10)在過(guò)敏性支氣管哮喘中的表達(dá)特征,及其在過(guò)敏性支氣管哮喘中對(duì)Th1細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet穩(wěn)定性的影響,從而對(duì)哮喘免疫狀態(tài)的調(diào)節(jié)作用。為支氣管哮喘的免疫學(xué)發(fā)病基礎(chǔ)提供新觀點(diǎn),并為尋求免疫學(xué)治療新方法提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　(一)過(guò)敏性哮喘中T-bet相關(guān)去泛素化酶研究:HEK293T細(xì)胞系中共表

2、達(dá)T-bet及多種T細(xì)胞中高表達(dá)的去泛素化酶,以免疫共沉淀篩選出與T-bet蛋白存在相互關(guān)系的去泛素化酶(以下表達(dá)為USPx),并在過(guò)敏性哮喘患者及健康對(duì)照者外周血PBMC及CD4+T細(xì)胞中通過(guò)熒光定量PCR方法檢測(cè)T-bet、GATA-3、Foxp3、IFN-γ和USPx mRNA表達(dá)水平。
　　(二)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn):HEK293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)T-bet與USPx質(zhì)粒,經(jīng)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)及免疫印跡法明確USPx對(duì)T-bet蛋白調(diào)

3、節(jié)作用的具體方式,并以免疫熒光共聚焦觀察兩種蛋白作用定位。槲皮素處理增強(qiáng)泛素化影響USPx作用,明確USPx對(duì)T-bet的調(diào)節(jié)方式。
　　(三)動(dòng)物模型研究:SPF級(jí)BALB/c小鼠隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、哮喘組及槲皮素處理組,每組8只,哮喘組以O(shè)VA致敏及激發(fā),對(duì)照組則以PBS代替OVA,槲皮素處理組則在哮喘組的基礎(chǔ)上,激發(fā)后腹腔注射槲皮素。血清總IgE及肺組織切片H&E染色評(píng)估各組病情,流式細(xì)胞術(shù)比較外周血、肺組織CD4+T細(xì)胞T

4、-bet、GATA-3、Foxp3、IFN-γ、USPx蛋白表達(dá),RT-PCR檢測(cè)以上組織內(nèi)細(xì)胞T-bet、GATA-3、Foxp3、IFN-γ、USPx基因mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.以免疫共沉淀篩選出USP10與T-bet蛋白間存在相互關(guān)系,TCR刺激使USP10表達(dá)升高。哮喘患者PBMC中T-bet、GATA-3、Foxp3、IFN-γ和USP10mRNA水平較健康對(duì)照組顯著提高,組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;哮喘患

5、者CD4+T細(xì)胞中IFN-γ升高,T-bet mRNA變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)USP10能夠通過(guò)去泛素化穩(wěn)定T-bet的表達(dá),兩者相互作用定位于細(xì)胞核。
　　3.槲皮素能夠增加哮喘中T-bet的泛素化并在HEK293T細(xì)胞系中降低USP10蛋白水平,人原代CD4+T細(xì)胞中槲皮素也能使T-bet、IFN-γ、USP10mRNA水平下降,使用蛋白酶體抑制劑組織泛素化后槲皮素對(duì)T-bet、IFN-γ、USP10表達(dá)

6、的抑制作用減弱。
　　4.動(dòng)物模型中,與陰性對(duì)照組比較,哮喘小鼠模型外周血及肺組織CD4+T細(xì)胞增加,T-bet、IFN-γ、GATA3、Foxp3及USP10蛋白水平明顯升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。槲皮素處理后外周血及肺組織中CD4+T細(xì)胞比例下降,T-bet、IFN-γ及USP10蛋白水平明顯下降。
　　結(jié)論：
　　1.病情穩(wěn)定的慢性持續(xù)期哮喘患者免疫細(xì)胞中T-bet、IFN-γ和USP10表達(dá)水平與健康對(duì)照相比明顯升高

7、。USP10能與T-bet產(chǎn)生相互作用,并能隨著TCR刺激表達(dá)增加。提示USP10在哮喘的炎癥過(guò)程中參與Th1細(xì)胞的調(diào)節(jié)。哮喘患者CD4+T細(xì)胞中IFN-γmRNA升高但T-bet mRNA保持不變,提示USP10通過(guò)對(duì)T-bet蛋白翻譯后修飾來(lái)調(diào)節(jié)其功能。
　　2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)USP10與T-bet在細(xì)胞核中產(chǎn)生相互作用,并通過(guò)去泛素化穩(wěn)定T-bet的表達(dá)、增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性。槲皮素干預(yù)降低T-bet的同時(shí)降低USP10,此時(shí)T-b

8、et水平的下降可能為USP10下降后去泛素化功能下調(diào)導(dǎo)致T-bet降解加劇,以及槲皮素降低T-bet的上游因子IFN-γ分泌的共同作用。
　　3.哮喘小鼠模型中T-bet與USP10水平上升,槲皮素增強(qiáng)泛素化后哮喘小鼠炎癥組織CD4+T細(xì)胞在哮喘中T-bet、IFN-γ和USP10下降。再次證明USP10能通過(guò)去泛素化修飾T-bet蛋白,增加其表達(dá)和穩(wěn)定性有助于維持Th1型炎癥細(xì)胞的數(shù)量及功能。
　　4.穩(wěn)定的慢性持續(xù)期哮喘